肝纤维化是多种肝损伤因子持续作用于肝脏引起的损伤修复过程,其主要特征是肝组织内细胞外基质（ECM）的大量沉积引起肝脏结构紊乱和功能异常。研究发现,激活态肝星状细胞（HSCs）是ECM的主要合成和分泌细胞,因此,抑制肝星状细胞的活化,增殖是治疗肝纤维化的有效途径之一。随着国内、外学者对肝纤维化的深入研究,发现HSCs活化的过程受DNA甲基化的密切调控,肝纤维化相关基因的DNA甲基化水平可能对其转录和表达产生重要影响。为进一步探索肝纤维化过程中DNA甲基化发挥作用的新靶点,课题组提取原代肝星状细胞进行RRBS测序,分析发现小鼠肝纤维化过程中SUN2基因的甲基化水平异常升高,基因发生异常高甲基化可能引起该基因表达水平降低甚至沉默,此发现提示我们,SUN2可能参与肝纤维化过程。SUN2（SAD1/UNC84 domain containing protein-2）属于SUN结构域蛋白,哺乳动物中,SUN2在细胞核定位和迁移上起关键调控作用。另有研究发现,SUN2在乳腺癌,肺癌和中枢神经系统胚胎瘤等疾病中呈现低表达状态,SUN2通过抑制癌细胞增殖,促进细胞凋亡等方面发挥重要功能。但,SUN2在肝纤维化过程中的表达变化,其对肝星状细胞的调控功能及相关机制研究仍未有文献报道。此课题的研究内容主要包括以下五个部分:1.小鼠原代肝星状细胞,TGF-β1活化的HSC-T6细胞和LX-2细胞中SUN2的表达变化体内实验:C57BL/6小鼠60只（雄性,4周龄,体重20g-22g）,随机分为正常组和肝纤维化模型组（每组30只）。模型组小鼠腹腔注射10%CCl₄橄榄油溶液（0.002ml/g）,每周2次,造模4周,建立小鼠肝纤维化模型。同时,正常组小鼠腹腔注射等体积的橄榄油溶液。造模结束后,断食24h。处死正常组和模型组小鼠,分别收集肝脏组织,血清,灌流提取原代肝星状细胞。通过HE染色,血清ALT和AST生化指标,检测肝组织损伤情况;通过Masson染色,检测肝组织胶原沉积情况;通过免疫荧光双染,检测SUN2和肝纤维化标志物之一α-SMA的共定位情况;通过免疫组化,Real-time PCR和Western blot技术,检测SUN2的表达水平。实验结果发现,小鼠肝纤维化模型构建成功,SUN2在肝纤维化小鼠中表达降低。体外实验:大鼠肝星状细胞HSC-T6和人肝星状细胞LX-2由TGF-β1刺激活化,通过Real-time PCR和Western blot技术检测SUN2的表达水平。实验结果发现,SUN2在TGF-β1活化的HSC-T6细胞和LX-2细胞中也呈现低表达。2.在体过表达SUN2对CCl₄诱导的小鼠肝纤维化进程的影响构建SUN2过表达腺相关病毒,尾静脉注射小鼠体内。感染肝脏十天后,开始CCl₄诱导小鼠肝纤维化形成。通过HE染色,血清ALT和AST生化指标,检测在体过表达SUN2对肝损伤的影响;通过Masson染色,检测在体过表达SUN2对肝组织胶原沉积的影响;通过免疫组化,Real-time PCR和Western blot技术,检测在体过表达SUN2对肝纤维化相关指标α-SMA和Col1α1表达水平的影响。实验结果发现,肝纤维化过程中,在体过表达SUN2可减轻肝损伤,减少肝组织胶原沉积,并发挥抑制α-SMA和Col1α1表达的功能。3.HSC-T6细胞中过表达SUN2对细胞活化,增殖和凋亡的影响构建SUN2过表达质粒,转染HSC-T6细胞,TGF-β1（10ng/ml）刺激细胞活化。通过Real-time PCR和Western blot技术,检测过表达SUN2对α-SMA和Col1α1表达水平的影响;通过MTT法,检测过表达SUN2对HSC-T6细胞增殖的影响;通过流式细胞术,检测过表达SUN2对HSC-T6细胞周期和凋亡的影响。实验结果发现,TGF-β1活化的HSC-T6细胞中,过表达SUN2可降低α-SMA和Col1α1表达水平,并通过将细胞周期阻滞在G0/G1期而发挥抑制细胞增殖的功能,但过表达SUN2对细胞凋亡的影响不具有统计学意义。4.HSC-T6细胞中过表达SUN2对AKT信号通路和细胞周期相关蛋白的影响在HSC-T6细胞中过表达SUN2,同时,给予PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002。通过免疫共沉淀技术,检测HSC-T6细胞中SUN2和p-AKT的结合作用;通过Western blot技术,检测HSC-T6细胞中过表达SUN2对p-AKT,c-myc和cyclinD1蛋白水平的影响;通过Western blot技术,检测HSC-T6细胞中过表达SUN2,同时,阻断AKT磷酸化对c-myc和cyclinD1蛋白水平的影响;实验结果发现,过表达SUN2可抑制AKT活化磷酸化,以及细胞周期相关蛋白c-myc和cyclinD1的表达水平,另外,SUN2发挥阻滞细胞周期的功能可能与AKT信号通路有关。5.肝纤维化过程中甲基化转移酶DNMT3b调控SUN2表达体内实验:小鼠体内注射DNA甲基化转移酶抑制剂（1mg/kg）,并构建CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型,灌流提取原代肝星状细胞。通过免疫组化,Real-time PCR和Western blot技术,检测抑制DNA甲基化转移酶对SUN2表达水平,以及肝纤维化相关指标α-SMA和Col1α1表达的影响。实验结果发现,肝纤维化过程中,抑制DNA甲基化转移酶的高表达,可一定程度上增加SUN2的表达水平,并且抑制α-SMA和Col1α1的表达。体外实验:HSC-T6细胞给予DNA甲基化转移酶抑制剂（1μM）,TGF-β1刺激HSC-T6细胞活化,构建3种DNA甲基化转移酶干扰小RNA（DNMT1-RNAi,DNMT3a-RNAi,DNMT3b-RNAi）和空载体scrambled-RNAi,分别转染HSC-T6细胞。通过甲基化特异性PCR技术,检测HSC-T6细胞中抑制DNA甲基化转移酶对SUN2基因甲基化水平的影响;通过Real-time PCR和Western blot技术,检测干扰3种DNA甲基化转移酶对SUN2表达水平,以及肝纤维化相关指标α-SMA和Col1α1表达的影响。实验结果发现,在TGF-β1激活的HSC-T6细胞中,抑制DNA甲基化转移酶的表达,可降低SUN2基因的高甲基化水平,干扰甲基化转移酶DNMT3b,SUN2表达显著上调,并且对肝纤维化相关指标发挥抑制性作用。