当前，新能源、新食品资源的开发是世界各国都在研究的重大课题，其中纤维素科学、纤维素的降解成为课题的主要组成部分。纤维素降解的方法有很多，常用的酸或高温处理的方法虽然也能降解纤维素，但同时会产生很多难以接受的副产物，污染环境，并使葡萄糖受到破坏。于是人们把目光逐渐转移到纤维素的酶解，但目前纤维素酶对纤维素的降解效率太低，成为大规模推广使用的制约因素。人们试图利用蛋白质工程的手段对纤维素酶系的主要组分(如CBHI)和其它丝状真菌的纤维素酶进行改造，以改善酶的性质，用于工业生产。这样就需要一个能高效表达丝状真菌纤维素酶的表达系统。实践证明纤维素酶在大肠杆菌中不能成功大量表达。丝状真菌虽然能大量分泌纤维素酶且适合工业化生产，但作为蛋白质工程的表达系统转化效率非常低，并且转化子的筛选费时又费力，不适合高逋量筛选。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系能表达单一的酶，且自身分泌的蛋白非常少，利于下游蛋白的纯化，而成为人们关注的焦点。 毕赤酵母与高等真核细胞非常接近，可对表达的蛋白质进行翻译后的修饰，如信号序列的加工、蛋白质的折叠、二硫键形成以及糖基化等，使表达的外源蛋白具有天然蛋白所应有的生物学活性。但有些蛋白在毕赤酵母中分泌表达时会发生过度糖基化，又是毕赤酵母表达系统的缺点。 目前纤维素酶在毕赤酵母中表达的研究报道并不多见。1999年，ShubhadaGodbole等报道了其在毕赤酵母中表达瑞氏木霉外切纤维素酶CBHI的结果，外泌的CBHI的V<,max>是瑞氏木霉中自然分泌的CBHI的l％，通过western分析发现，表达出来的CBHI被高度糖基化，Shubhada Godbole等分析认为在两种宿主中糖基化程度不同可能是造成CBHI在酵母中表达后酶活低的主要原因。基于上述分析，我们希望通过对CBHI的糖基化位点进行改造，研究过度糖基化对CBHI在酵母中表达酶活力的影响，为构建丝状真菌纤维素酶的酵母表达系并开展纤维素酶的蛋白质工程工作做准备。 本研究通过点突变的方法，对CBHI的四个N-糖基化位点进行改造，将其45、64、270和384位的天冬酰胺突变为丝氨酸，构建重组质粒，并在毕赤酵母中进行表达，以研究过度糖基化对酵母中表达的CBHI酶活力的影响。 结果表明：64位N一糖基化位点突变后，酶活比未突变的重组CBHT和其它位点突变的CBHT要高，但仍然比瑞氏木霉分泌的天然CBHT要低很多，说明Asn64位的糖基化对毕赤酵母中表达的CBHI的酶活影响较大，而其他三个位点的糖基化的影响较小，同时也表明Asn64位的糖基化只是影响毕赤酵母中表达的CBHI酶活力的一个方面。