癌症是一种危害全世界人民身体健康的疾病,仅2018年新发病例达1,810万,死亡病例960万。由于其发现难、诊断难、易转移等特点,导致目前癌症的彻底性治疗研究依然很艰巨。因此,本文主要是基于微流控技术构建了恶性肿瘤无创诊断的三种方法并进行了临床应用测试。与此同时,研发了基于“肿瘤芯片”的免疫治疗途径,初步探讨了应用自然杀伤细胞(NK)分泌的外泌体来进行的肿瘤抑制效果研究,以期为临床上肿瘤筛查、治疗提供新的思路。首先,我们研发了集成的微流控芯片,可在芯片上进行尿液脱落肿瘤细胞分离、富集及芯片-ELISA定量检测,从而量化膀胱癌患者尿液样本中的脱落肿瘤细胞数量。该芯片的检测的原理,主要是基于尺寸排阻,即通过一个尺寸为在5μm的聚碳酸酯膜的微流控芯片来分离、富集尿液样本里的脱落肿瘤细胞。同时针对所分离到的细胞进行了扫描电镜、荧光染色及突变点测序分析以验证其为脱落肿瘤细胞,并利用直接ELISA方法在芯片上原位定量检测分析脱落肿瘤细胞的数量。检测结果显示:与健康的供试者相比,膀胱癌患者尿液样本里的脱落肿瘤细胞数量显著性的提高。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,利用该芯片初筛膀胱癌的方法具有很好的效果,当特异性在90%的条件下,检测方法的灵敏性为77.1%。其次,我们研发了一种单膜的微流控芯片用以过滤尿液样本,目的是先对尿液样本进行纯化处理,再进行游离核酸的提取和检测分析。该方法主要是对芯片过滤后的尿液样本里的cell-free DNA进行含量的检测分析和DNA完整性扩增比较。结果可知,根据所分离得到的cell-free DNA完整性检测及丰度分析有效地初步将膀胱癌患者从健康人群中初步区分出来,该方法的特异性设定为90%的时候灵敏性为88.6%。第三,我们研发了 一种基于微流控技术的双膜(30 nm和200 nm)过滤芯片用来分离、富集尿液样本里的外泌体。同时针对所分离到的外泌体进行了透射电镜、荧光染色、纳米粒径及动态光散射分析以表征其特征,然后借助芯片ELISA方法定量分析尿液中外泌体的量。结果发现,所捕获到的外泌体成椭球型,粒径大小主要在105 nm左右。经24例临床样本测试分析显示该方法在特异性设定为90%的时候灵敏性为81.3%,利用该方法可以将膀胱癌患者从健康人群中初步区分出来,符合即时诊断条件和要求。最后,我们研发了“食管癌肿瘤芯片”和“乳腺癌肿瘤芯片”等肿瘤芯片,利用自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)分泌的外泌体分别与肿瘤细胞在二维(2D)和三维(3D)动态条件下进行共培养,同时通过细胞活/死染色、CCK8细胞毒性测试及流式细胞分析等手段表征了NK细胞外泌体对肿瘤细胞的杀伤效果。结果显示,无论是在2D还是在3D动态条件下,NK细胞外泌体对食管癌芯片和乳腺癌芯片里边的肿瘤细胞具有一定的杀伤效果。相比较2D条件而言,3D动态环境中NK细胞外泌体对肿瘤细胞的杀伤效果更明显。