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一、研究目的程序性死亡(programmed cell death,PCD)是一种可调控的、细胞主动的死亡过程,是多细胞生物维持正常的生长发育和机体稳态所必需的。凋亡(apoptosis)是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)依赖的PCD,会引起细胞内成份有序地形成“凋亡小体”,然后被周围细胞吞噬,是一种快速有效清除死亡细胞的方式。细胞程序性坏死(necroptosis or programmed necrosis)是近年来新发现的一类PCD,由特定因子启动,按照一定通路和程序发生,发生后会造成细胞破裂,引起周围组织的炎症反应。迄今证实包括受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting serine/threonine kinase,RIPK)1、RIPK3、混合谱系激酶样蛋白(mixed lineage kinase like protein,MLKL)、PGAM5和Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA binding protein 1,ZBP1)、头帕肿瘤综合征蛋白(cylindromatosis,CYLD)等基因参与细胞程序性坏死调控。RIPK3属于RIPK家族,是程序性坏死通路上的关键分子,与RIPK1、MLKL组成复合物IIb(necrosome)。Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associating death domain protein,FADD)是凋亡通路中的重要调控分子,通过与Fas结合促进凋亡,是复合物IIa的组成部分。肿瘤抑制因子CYLD是一种特异性去除K63连接泛素链的去泛素化酶,通过去泛素化RIPK1调控程序性坏死。CYLD的D215位点可被caspase-8进行切割,影响CYLD对RIPK1的去泛素化,RIPK1无法向下激活细胞坏死通路,从而阻断细胞死亡。然而,CYLD是否影响坏死通路中其他蛋白,具体作用机制尚未阐述清楚,小鼠在体的结果未见报道。研究证实FADD和RIPK3参与多种疾病的发生发展,包括病毒感染、细菌感染、心血管疾病、缺血性损伤、动脉粥样硬化、慢性肠炎、胰腺炎、肝脏损伤等。然而FADD和RIPK3在真菌感染中是否发挥作用尚不清楚。在主要的真菌感染中,新生隐球菌感染是其中一种对免疫力低下和免疫力正常人群均有致命危险的真菌感染。隐球菌感染后,机体无法产生有效的免疫反应,免疫治疗导致的过度炎症加剧病程恶化。既往研究提示,隐球菌感染能够引起巨噬细胞和T细胞死亡,但是这种由隐球菌引起的死亡在宿主对隐球菌免疫反应调节方面的作用并不明确。因此,本课题进行以下两方面研究:研究CYLD的D215A位点突变对凋亡和程序性坏死的影响及其具体机制;采用小鼠经鼻吸入隐球菌模型,研究RIPK3和FADD对隐球菌病肺部免疫的调控。二、研究方法(一)CYLD及其D215A点突变对程序性死亡的调节作用构建CYLD点突变小鼠(CyldD215A/D215A),分离得到原代小鼠皮肤成纤维细胞(mouse dermal fibroblast,MDF)和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM),体外刺激检测CYLD的D215A点突变对凋亡和程序性坏死的影响,并研究其分子机制。同时,检测CYLD的D215A点突变对NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)、炎性小体激活的影响,并利用雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型、LPS+z VAD诱导的坏死模型和anti-Fas诱导的凋亡模型,在体研究CYLD及其D215A点突变的作用。(二)RIPK3/FADD在隐球菌感染肺部免疫中的作用研究以隐球菌经鼻吸入感染模型为基础,应用Ripk3-/-和Ripk3-/-Fadd-/-小鼠,通过研究感染后小鼠生存率变化、重要脏器菌落负荷变化,分析上述通路在宿主对隐球菌免疫反应的调控作用,并结合组织病理、多色流式分析肺部白细胞类群和细胞因子分泌变化、肺相关淋巴结中树突状细胞功能变化、巨噬细胞极化和杀伤功能变化及白细胞亚群凋亡比例变化等深入分析了上述通路发挥调控作用的机制。三、结果(一)CYLD及其D215A点突变对程序性死亡的调节作用MDF和BMDM细胞中,CYLD敲除抑制凋亡和程序性坏死,CYLD的D215A点突变促进凋亡和程序性坏死。Cyld D215A/D215AMDF在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)+Smac凋亡处理时就发生程序性坏死,免疫荧光显示存在RIPK3和RIPK1的聚合。免疫沉淀表明CYLD的D215A点突变通过促进RIPK1和RIPK3聚合来促进凋亡和程序性坏死。CYLD的D215A点突变对NF-κB、MAPKs、炎性小体激活的没有影响。CYLD及其点突变质粒在293T中与RIPK1、RIPK3、MLKL均有相互作用,D215A点突变促进RIPK3的磷酸化。同时敲除CYLD并不能使Fadd-/-小鼠存活,CYLD的D215A点突变不影响雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型、LPS+z VAD诱导的坏死模型和anti-Fas诱导的凋亡模型。(二)RIPK3/FADD在隐球菌感染肺部免疫中的作用研究本研究发现,Ripk3-/-和Ripk3-/-Fadd-/-小鼠吸入感染新生隐球菌后,生存时间均明显缩短。FADD和RIPK3的缺失引起小鼠隐球菌感染后肺部免疫反应的失控:肺组织炎性细胞大量浸润、肺组织结构破坏严重;浸润的白细胞以中性粒细胞为主,计数较野生型(wild type,WT)小鼠明显上升,同时嗜酸粒细胞计数显著降低;产生过强的1型T辅助细胞(Th1)相关细胞因子极化,TNFα、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等及干扰素γ(interferonγ,IFNγ)、IL-12等分泌剧烈增加,而IL-4、IL-33分泌大幅减少。FADD/RIPK3缺失引起的过强的免疫反应同肺相关淋巴结中树突状细胞的过度成熟、激活相关。最后,通过分析肺白细胞亚群凋亡比例变化发现,FADD/RIPK3可能通过参与调控中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及CD4+T细胞凋亡及关键细胞因子表达来维持肺部免疫反应平衡。四、结论一、本研究首次在原代细胞中证明CYLD的D215A点突变促进凋亡和程序性坏死的发生,CYLD的D215A点突变不影响NF-κB、MAPKs通路及炎性小体的激活;Cyld D215A/D215A小鼠原代细胞在体外表现出促进凋亡和坏死的表型,而不影响在体的凋亡和坏死模型的表型,可能是由于CYLD对于程序性坏死的发生并不是必需条件,CYLD的作用似具有组织特异性。二、FADD和RIPK3协同在隐球菌感染过程中发挥保护性作用,其机制可能是通过调节中性粒细胞、嗜酸粒细胞及CD4+T细胞凋亡及关键细胞因子表达来维持肺部免疫反应平衡。以往认为的隐球菌感染后Th1反应即“保护性反应”是片面的,其需要FADD和RIPK3精确的负调控机制才能促进真菌清除。