论文部分内容阅读
高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)是由一些H5和H7亚型禽流感病毒引起的高致病性和高死亡率的烈性禽类传染病,对养禽业造成严重的危害,并具有重要的公共卫生学意义。DNA疫苗是可以有效防控禽流感的基因工程疫苗之一,已经获批一类新兽药证书,现地应用需要相应配套的、更敏感的评价和检测方法。因此,本研究拟建立一种比HI方法更为敏感的ELISA方法,为基因工程疫苗的推广应用提供必要的技术支撑。采用杆状病毒表达系统来表达当前主要流行毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013(CK/GZ/4/13(H5N1))、A/Duck/Guizhou/S4184/2017(H5N6)(DK/GZ/S4184/2017(H5N6))和A/Chicken/Guangxi/SD098/2017(H7N9)(CK/GX/SD098/17(H7N9))的真核表达HA蛋白。分别以CK/GZ/4/13(H5N1)、CK/GX/SD098/2017(H7N9)和DK/GZ/S4184/2017(H5N6)的HA基因为模板,将目的片段通过PCR扩增克隆至昆虫表达载体pFastBac1中构建重组质粒pFastBac1-HA;再将其转座至DH10Bac感受态细胞,利用蓝白斑筛选得到重组杆粒rBacmid-HA;利用脂质体转染的方法将重组杆粒转染SF9细胞并获得重组杆状病毒;采用间接免疫荧光试验(IFA)、western blot对所表达的蛋白进行表达鉴定;并利用Hi5细胞大量表达HA蛋白并对其进行纯化。结果表明H5HA和H7HA蛋白具有良好的抗原性,可初步作为检测方法的良好抗原。H5和H7亚型间接ELISA检测方法的建立。首先采用棋盘滴定法确定抗原和血清的最佳结合浓度,再通过控制变量的方法来依次确定封闭液的选择及作用时间、一抗稀释液的选择及作用时间、酶标二抗的最佳稀释浓度及作用时间,最后进行临界值的确定、重复性、特异性及灵敏性试验的检测并进行临床样品检测,从而建立间接ELISA抗体检测方法。其中H5亚型最佳工作条件为:用包被浓度为2 ng/μL的蛋白包被ELISA板,采用1%BSA封闭液封闭2 h,一抗血清使用商品化一抗稀释液按照1:50倍稀释并孵育1.5 h,酶标二抗则按照1:2000倍稀释孵育1h,建立的H5亚型ELISA方法具有良好的灵敏性和特异性,和HI的相关性方程为y=9.616*x-1.888,R~2=0.8246,相关性良好;至于H7亚型间接ELISA方法的工作条件,除了包被蛋白的浓度为5 ng/μL外,其余均与H5亚型相同。建立的H7亚型的间接ELISA方法灵敏性较好,但和其他亚型存在交叉反应,和HI相关性方程为y=9.139*x+0.3650,R~2=0.7873,存在较好的相关性。间接ELISA抗体检测方法的建立为下一步试剂盒的研制打下了良好的基础。