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研究背景和目的:Ⅰ型糖尿病是由于自身免疫反应破坏胰腺β细胞,导致胰岛素分泌绝对不足,但是,外源性胰岛素注射无法正确控制血糖而导致慢性并发症。胰腺或胰岛移植可以重建内源性胰岛素的分泌,然而供体不足和免疫抑制剂的使用都限制了这一方法的运用。基因改造非β细胞治疗Ⅰ型糖尿病是目前研究的方向,它需要能根据生理性的血糖浓度变化合成和分泌有生物活性胰岛素的靶细胞以替代胰岛β细胞的作用。我们利用糖反应性的启动子和人胰岛素基因改造K细胞,使其分泌有生物活性的成熟胰岛素并能够受葡萄糖的调控,探索代替胰岛素注射或胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的方法。 方法:将大鼠糖依赖性胰样多肽(GIP)启动子插入以萤虫素酶为报告基因的载体pGL3-Basic,构建pGL3-Basic-GIP表达质粒,通过瞬时转染细胞测定萤虫素酶活性。将人胰岛素基因置于GIP启动子控制下,构建重组质粒pCDNA3-GIP-hIns,经脂质体介导转染小鼠的肠道内分泌肿瘤细胞系STC-1(K细胞的体外研究模型),筛选稳定表达胰岛素的细胞株。改变单克隆细胞株培养液中葡萄糖浓度,RIA法检测胰岛素的表达。链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病裸鼠模型,将基因改造过的细胞株以1×10~7移植到糖尿病裸鼠皮下,监测裸鼠血糖、体重及胰岛素水平变化。 结果:萤虫素酶活性测定证实葡萄糖上调GIP启动子的转录活性,质粒pCDNA3-GIP-hIns转染STC-1细胞,筛选共得到22株表达不同水平胰岛素的单克隆细胞(0～157.241uIU/ml/10~6cells/d)。挑选两株胰岛素分泌量较高的细胞STC-1-2和STC-1-12,改变其培养液中的葡萄糖浓度时,胰岛素的表达量分别为40.252±0.844、56.333±3.184(葡萄糖浓度:1mM、10mM,P<0.05),10.820±0.824、23.632±2.264uIU/ml(1、10mM,P<0.05)。当基因改造过的细胞被移植到STZ诱导的糖尿病裸鼠体内,7只移植STC-1-2细胞的治疗组糖尿病裸鼠血糖下降至正常范围,体重恢复;而移植空载体转染细胞的对照组糖尿病裸鼠血糖始终维持在较高水平,体重持续下降。糖耐量实验显示治疗组裸鼠利用糖的能力恢复正常,糖耐量曲线和正常组相似。 结论:上述结果表明人胰岛素基因和糖反应性GIP启动子构建的质粒转染STC-1细胞,能够建立稳定表达有生物活性的胰岛素并受葡萄糖调控的细胞株,这些细胞株移植入裸鼠体内,能有效控制血糖,改善糖耐量情况。证实STC-1-12细胞移植入裸鼠体内仍保持对葡萄糖的反应而分泌胰岛素的特性。基因改造K细胞有