原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国乃至全世界常见的恶性肿瘤之一,全球发病率逐年增长,目前已超过74.8万/年,排名第五,死亡人数接近69.6万/年,位居肿瘤相关死亡的第三位[1]。早中期HCC患者的主要治疗手段是手术切除,但由于HCC早期不易发现,确诊时多属晚期,已失去手术机会,对无法行手术治疗的晚期HCC,以索拉菲尼为主的分子靶向治疗是一种重要的治疗手段,它是全球第一个也是唯一被多国批准用于不可手术切除的晚期原发性肝癌治疗的药物。索拉菲尼为小分子靶向药物,是作用于丝氨酸/苏氨酸激酶及受体酪氨酸激酶的多激酶抑制剂,主要通过抑制肿瘤新生血管的形成、抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞的凋亡来抑制肿瘤生长。国际多中心临床研究SHARP(索拉菲尼治疗晚期肝细胞癌的全球Ⅲ期随机、安慰剂对照临床试验)和Oriental(索拉菲尼治疗晚期肝细胞肝癌的亚太地区Ⅲ期随机、安慰剂对照临床试验)已充分证明,索拉菲尼能延缓HCC的进展期,明显延长晚期患者总生存期,且有较好的安全性。且不同的地域、基线水平及预后因素的HCC患者都有临床获益,疗效相当。然而肿瘤发生的机制复杂,因素众多,单一使用分子靶向药物其有效性及延长病人的生存期是有限的,故新近出现的一些大型的临床试验,旨在探索索拉菲尼与其他抗肿瘤药物及手术、微创治疗手段的联合应用治疗晚期原发性肝癌,如这也将是今后临床研究的热点:在亚洲地区进行的索拉菲尼联合TACE治疗肝癌的疗效及安全性的前瞻性、开放性Ⅱ期的START研究表明,联合治疗延长TACE治疗间隔,保护肝功能,同时具有良好的安全性及耐受性;但评估索拉菲尼用于肝癌切除术或射频术后辅助治疗预防肝细胞癌复发的STORM试验表面其无进展生存时间、中位复发转移时间和总生存期均未改善,没有出现药物安全性意外。2012年报道的一项Ⅱ期临床试验(NCT00619541)索拉菲尼与5-氟尿嘧啶联合治疗晚期肝癌患者,中位进展时间为8个月,中位生存时间为13.7个月,提示两者合用是安全的并且能提高索拉菲尼的疗效。与此同时,HCC对索拉菲尼耐药的出现已成为阻碍HCC患者总体生存期进一步延长的主要因素,受到广泛的关注。目前,对索拉菲尼耐药机制的研究已有较多发现,很多逆转耐药的联合用药方案应运而生,但大多数处于临床前研究,目前为止没有重大突破:如在大鼠体内吉非替尼与索拉菲尼联用,较索拉菲尼单用相比,可进一步抑制HCC的生长;部分试验得出的结果互相矛盾,如Bareford等[2]用索拉菲尼与自噬诱导剂培美曲塞联合培养HCC细胞,发现索拉菲尼与培美曲塞可起协同作用,但Shimizu等的研究却提示没有协调作用。由上可知,索拉菲尼联合其他微创或药物治疗HCC尚未取得重大突破,探索其他新药治疗HCC为晚期HCC患者带来新的希望。由拜耳公司赞助的一项随机、双盲、多中心、安慰剂对照Ⅲ期临床试验正在进行中,这项实验的目的在于评估瑞戈非尼(regorafenib)治疗索拉菲尼治疗失败后的晚期HCC患者的安全性和有效性,主要终点目标为总生存期OS。Regorafenib是一种新型二苯脲类广谱激酶抑制剂,可广泛抑制与血管生成和肿瘤发生相关的靶激酶,如血管内皮生长因子受体VEGFR-2和-3、酪氨酸蛋白激酶受体TIE-2和Ret、血小板衍生生长因子受体PDGFR-β、原癌基因编码的酪氨酸蛋白激酶c-Kit和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶c-Raf、碱性成纤维细胞生长因子受体bFGFR-1以及有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶p38等,从而发挥抗肿瘤作用。2012年9月27日FDA批准,regorafenib用于既往系统性癌症治疗后病情恶化的肠胃道间质瘤(GIST)患者。在一项名为CORRECT的治疗侵袭性大肠癌的Ⅲ期试验中,Regorafenib与安慰剂相比,可使患者整体生存率提高29%,其中位整体生存时间为6.4个月(而安慰剂为5个月),这有助于Regorafenib获准治疗大肠癌。由瑞戈非尼抗肿瘤的机制可看出,它亦是一种阻断肿瘤血管生成的药物,掐断肿瘤供血,造成缺氧、缺乏营养物质的肿瘤缺血缺氧微环境,早期可观察到实体肿瘤的坏死,但部分肿瘤细胞可发生一系列适应性改变,在劣境中存活下来,并产生耐药性,这些适应性改变如下述:缺血缺氧微环境可诱导生成细胞内活性氧(reactiveoxygen species,ROS)的积聚;进一步缺氧可导致肿瘤细胞发生自噬、凋亡甚至坏死,释放一系列炎症因子如a-TNF、IL-6、HMGB1等,诱导肿瘤局部炎症反应,进一步促进肿瘤的发生发展。一般认为a-TNF、IL-6为后炎症因子,而HMGB1即可作为前炎症因子又可做为后炎症因子,低氧的肿瘤微环境直接释放前炎症因子HMGB1,并且随着ROS的增加可产生不同功能的HMGB1,可与TLR4和/或RAGE结合,最终激活NFkB炎症通路,进一步促进多种炎性细胞因子的转录和释放,如IL-6、a-TNF及自身(后炎症因子)等,进一步促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。很多研究亦发现血清HMGB1水平在HCC患者中升高,并且HMGB1在肝脏的表达与肝癌病理分级、远处转移、耐药密切相关。HMGB1的靶向治疗研究显示,应用RNA干扰、EP(丙酮酸乙酯)、乙酰半胱氨酸抑制HMGB1的表达、释放和活性,可以抑制结肠癌转移性肝癌模型的肿瘤生长。这些研究提示HMGB1在HCC的发展过程和治疗中起着关键性作用。2011年,Hanahanand Weinberg更新他们的癌症中心理论[3],提出促进癌症发生和生长的十大基本特性,其中有两条为“促肿瘤炎症、侵袭和转移、血管生成和抵抗细胞坏死”,而这些特征与HMGB1的定位、过表达或水平密切相关,所以把HMGB1放在现代理解癌症生物学的核心位置。索拉菲尼抑制肿瘤血管生成、缺血缺氧微环境的形成并最终导致的肿瘤细胞坏死炎症反应很可能与HMGB1有关,但目前尚无HCC应用索拉菲尼后HMGB1变化情况的相关报道。索拉菲尼治疗其他肿瘤的启示:索拉菲尼对肾癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤等恶性疾病具有较好的有效性和安全性,同样因为这些肿瘤的发生机制非常复杂,因素众多,如果单独使用一种靶向药物治疗,有效率及生存期都要受到一定的制约,研究如何与索拉菲尼治疗肿瘤,提高患者的治疗效果及生存期限仍是今后研究的重点。SHALI ZHANG[4]等人通过基因库增殖分析从2000种药物中筛选出氟伐他汀钠与索拉菲尼联合治疗体外恶性黑色细胞瘤具有协同作用,主要是通过增强索拉菲尼促进肿瘤细胞凋亡起作用,氟伐他汀钠具有相对廉价、患者容易获取且副作用小的临床特点,故两者合用临床可行性高,期待着进一步的临床试验研究证实其在人体内是否有增强索拉菲尼治疗恶性黑色素瘤的作用。氟伐他汀钠,起初作为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂,临床上用来降低胆固醇含量,治疗原发性高胆固醇血症和原发性混合型血脂异常。后来研究表明它也能抑制全身炎症反应及抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡、侵袭和转移,有望成为抑制肿瘤的新药物。首先,氟伐他汀钠在抑制炎症性疾病(如心血管疾病、支气管哮喘、自身免疫性疾病等)的作用已经大量研究证实:氟伐他汀钠能抑制炎症因子[5,6]、趋化因子和粘附分子的表达,抑制TLR4-NFKB、HMGB1-RAGE炎症通路发挥抗炎症作用[7-11];同时具有Treg和抗原提呈细胞(APC)的功能,在免疫调节中其重要作用[12,13];Araujo等[14]人研究发现氟伐他汀钠能通过降低VEGF、a-TNF、NO水平,抑制炎症相关血管的生长。其次,氟伐他汀钠抑制肝癌细胞的研究也较多:来自台湾的一项大型回顾性分析显示[15],他汀类药物使用能降低28%HCC发生风险率;Zhang[16]等人用氟伐他汀钠作用于三株肝癌细胞株(HepG2,SMMC-7721及MHCC-97H),观察到氟伐他汀钠能抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡、降低侵袭潜能,且呈剂量依赖性;Gao J[17,18]等人用氟伐他汀钠联合塞来昔布治疗肝癌细胞株BEL-7402移植瘤模型的小鼠,发现两者合用组较单用组肿瘤体积显著减少,肿瘤细胞凋亡显著增加。索拉菲尼与氟伐他汀钠联合应用于HCC的研究尚未见报导。综上,原发性肝细胞癌为典型的炎症相关肿瘤,以广泛的炎症和纤维化为特征,而索拉菲尼治疗晚期HCC的主要作用机制为抑制血管生成,掐断血液、营养供应,起到“饿死”肿瘤的目的,但由此造成的肿瘤缺血缺氧微环境,可能促进细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积聚,激活炎症相关反应通路,最终刺激释放一系列炎症因子,使周边的肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。氟伐他汀钠已证实能抑制缺氧微环境中的炎症反应,且亦有能直接抑制肝癌肿瘤细胞的增殖、侵袭,促进凋亡,故将其与索拉菲尼联用治疗HCC,有望能克服应用索拉菲尼后诱发的肿瘤炎症反应,并能协调抑制肝癌细胞的增殖,增强索拉菲尼的疗效。目前,尚无氟伐他汀钠联合索拉菲尼治疗HCC的报道。第一部分Wistar大鼠肝癌模型的建立目的:建立Wistar大鼠肝癌模型,经HE染色证实模型建立成功后,为进一步用药治疗提供前提。材料与方法:清洁级雄性Wistar大鼠(5周龄,体重150～180g)60只,将其随机分为2组:肝癌模型组(n=56);正常组(n=4),肝癌模型组腹腔注射二乙基亚硝基胺(DEN)(SigmaN0756)50mg/kg/周,正常组腹腔注射同比例生理盐水,其余喂养条件一致。每周称重并观察其生存情况。分别于第8周、第14周随机抽取肝癌模型组大鼠2只及正常组大鼠1只取肝脏组织行HE染色明确有无肝癌形成。结果:第8周主要为肝炎肝硬化期及早期肝癌增生结节表现;第14周表现为肝癌期。结论:DEN诱导大鼠肝癌模型是可行的,方法简单,致癌率高,其病理改变与人类肝硬化所致肝癌形成模式相似,是一种比较理想的实验模型。本实验经HE染色证实造模成功。第二部分氟伐他汀钠联合索拉菲尼治疗大鼠HCC目的:观察氟伐他汀钠与索拉菲尼联合用药治疗大鼠肝癌是否优于索拉菲尼单用组。材料与方法:造模成功的52只大鼠停止腹腔注射DEN,并随机分为4组:索拉菲尼组(Sor组)(10mg/kg/d,n=13)、索拉菲尼+氟伐他汀钠组(Sor组+Flu 组)(10mgmg/kg/dSorafenib+4mgmg/kg/dFluvastin,n=13)、氟伐他汀钠组(Flu组)(4mg/kg/d,n=13)、对照组(两药均不用,n=13),均以灌胃方式给予相应剂量的药物,其余喂养条件一致。每周定期称量其体重、观察毛发变化情况及用药相关副反应。于用药8周后,4组中各随机抽取8只大鼠,麻醉下心脏采血、肝脏称重、计数肝脏肿瘤个数、切取肿瘤块于多聚甲醛固定或液氮保存,正常组2只大鼠行同样处理。肝癌模型4组各剩下5只大鼠继续按原方案治疗,观察其生存期。利用spss13.0进行统计学分析。结果:在治疗大鼠原发性肝癌8周后,两药合用组较索拉菲尼单药组一般生存状况较好,肝脏重量系数及肝脏负荷均最小,肝功能AST、ALT及肿瘤标志物AFP含量亦最低,两药合用治疗组较单药索拉菲尼治疗组总生存期有延长趋势,但差异无统计学意义,可能与样本量小有关。结论:索拉菲尼与氟伐他汀钠联合治疗DEN所致大鼠HCC能有效降低肿瘤负荷,保护肝功能,有延长总生存期趋势,两者合用具有更佳的疗效。第三部分氟伐他汀钠联合索拉菲尼增强治疗大鼠肝癌疗效的机制研究目的:经过动物体内实验,证实氟伐他汀钠可加强索拉菲尼抑制肝癌的作用,进一步探寻其机制。材料与方法:免疫组化检测HMGB1、TLR4、RAGE、P-NFKBp65、PCNA、Cleaved-Caspase3、p-STAT3、STAT3、VEGF、MMP9;Western 检测 ROS、TLR4、HMGB1、RAGE;ELISA 检测 HMGB1、IL-6、a-TNF。结果:1、免疫组化中p-STAT3、STAT3、VEGF、MMP9中各组无明显差异;在Sor组ROS、HMGB1、RAGE含量较对照组显著升高,在Sor组+Flu组显著降低;TLR4、p-NFKBP65在对照组及Sor组均升高,两者差异无统计学意义,但在两药合用组上述因子显著降低;PCNA在对照组表达量最高,Sor组+Flu组表达量显著最低;Cleaved-Caspase3在Sor组+Flu组表达量最高,与对照组及Sor组比较均有统计学差异。2、血清中IL-6、a-TNF、HMGB1在Sor组血清含量较对照组显著升高,尤其以HMGB1升高最为明显;Sor+Flu组与Sor组比较,炎症因子的含量显著降低。结论:氟伐他汀钠下调ROS引起的HMGB1转位、释放,从而抑制肿瘤细胞HMGB1/RAGE/NFKBP65炎症通路,从而使肿瘤细胞增殖减少,凋亡增加。对照组及Sor组TLR4、p-NFKBP65均升高,提示还存在其它诱发因子引发TLR4/p-NFKBP65的升高。总结:本研究通过利用DEN腹腔注射成功造出Wistar大鼠HCC模型后,分别给予索拉菲尼及氟伐他汀钠合用或单用灌胃治疗,得出如下主要结论:1.DEN诱导大鼠肝癌模型是可行的,方法简单,致癌率高。2.氟伐他汀钠能增强索拉菲尼抑制肝癌的疗效:能有效降低肿瘤负荷,保护肝功能,有延长总生存期趋势。3.氟伐他汀钠下调索拉菲尼所致ROS增加引起的HMGB1转位、释放,进一步抑制肿瘤细胞HMGB1/RAGE/NFKBP65炎症通路,从而使肿瘤细胞增殖减少,凋亡增加。