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目的:通过体外实验研究维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate; VES或称d-α-生育酚琥珀酸酯)对人食管癌Eca-109细胞株增殖、凋亡以及相关蛋白表达的影响,进一步探讨VES抑制食管癌细胞的作用机制,为食管癌治疗及化学预防提供理论依据。方法:1体外培养人食管癌细胞Eca-109 ,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)比色法检测不同浓度VES作用于该细胞24、48、72h后抑制率的变化;应用普通光学显微镜和透射电子显微镜观察细胞的形态学变化。应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析不同浓度(0,10,20,40μg/ml )VES对Eca-109细胞凋亡率的影响。2应用免疫细胞化学(immunocytochemistry,IC)方法定性观察维生素E琥珀酸酯处理Eca-109细胞48h后,Survivin、Caspase-3蛋白的表达情况。3采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)定量检测维生素E琥珀酸酯处理Eca-109细胞48h后,细胞中Survivin、Caspase-3蛋白表达的变化。结果:1 MTT比色法显示维生素E琥珀酸酯(5、10、20、40、80μg/ml)对Eca-109细胞增殖具有抑制作用。不同浓度维生素E琥珀酸酯处理Eca-109细胞24-72h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度下降,差异具有显著性(p<0.01)。各实验组间比较,差异亦具有显著性(P<0.01),随着VES处理浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐下降,抑制率逐渐升高,以80μg/ml VES作用72h为最高,可达68.73%。即维生素E琥珀酸酯对Eca-109细胞的增殖抑制作用呈明显的时间-剂量依赖效应。光学显微镜下观察未经维生素E琥珀酸酯处理的Eca-109细胞呈贴壁生长,细胞呈圆形、椭圆形或多边形。细胞透明,形态饱满,生长状态良好。而经维生素E琥珀酸酯处理48h后的Eca-109细胞变圆,皱缩,呈不规则形,细胞胞浆中出现空泡,脱落细胞数量明显增加。并且随着VES浓度的增加,凋亡细胞数目也随之增加。经Giemsa染色光学显微镜下显示,对照组Eca-109细胞呈菱形或多边形,形态饱满,细胞核染色均匀,核仁清晰可见,未见凋亡细胞出现;而经维生素E琥珀酸酯作用48h后的Eca-109细胞变圆,胞质浓缩,核着色不均匀,出现核分裂现象,呈现凋亡细胞的形态学改变。在透射电镜下观察,正常Eca-109细胞形态较大,呈椭圆形,胞膜完整,表面有大量绒毛样突起。细胞核大,呈椭圆形,核内常染色质丰富、均匀分散,密度一致。细胞质内细胞器丰富,可见内质网、线粒体、溶酶体等细胞器;经20μg/ml维生素E琥珀酸酯作用48h后的Eca-109细胞呈现不同程度凋亡改变:细胞体积缩小,微绒毛减少,胞质浓缩,胞浆中出现较多空泡,线粒体脊和膜部分或大部分融合消失,粗面内质网有脱颗粒现象,胞核局部向外呈锐角突起,核染色质电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜的新月体状,有的出现核固缩。2流式细胞仪检测细胞凋亡率显示10、20、40μg/ml维生素E琥珀酸酯作用Eca-109细胞48h后,出现典型的亚二倍体凋亡峰,随着维生素E琥珀酸酯浓度增大而逐渐升高,凋亡百分率分别为:14.147%±0.147%、21.167%±0.702%、36.087%±0.559%,较对照组有显著性统计学意义(p<0.05)。3免疫细胞化学检测Eca-109细胞Survivin、Caspase-3蛋白表达,按照HIS值法进行免疫组化评分。对照组Eca-109细胞中Survivin染色为阳性,细胞的胞浆呈现棕黄色颗粒,颗粒粗大;药物处理组细胞随药物浓度增加,染色强度逐渐减弱,颜色变淡,颗粒变细,阳性细胞数逐渐减少。评分统计后VES处理各组Survivin蛋白表达值(HIS值)随药物浓度增加,逐渐降低,各处理组和对照组相比有显著性差异(p<0.01)。对照组Eca-109细胞中Caspase-3染色为弱阳性;药物处理组细胞随药物浓度增加,染色强度明显增强,颜色变浓,颗粒变粗大,阳性细胞数逐渐增多。评分统计后VES处理各组Caspase-3蛋白表达值(HIS值)随药物浓度增加,逐渐升高;各处理组和对照组相比有显著性差异(p<0.01)。4流式细胞术检测结果显示:0、10、20、40μg/ml维生素E琥珀酸酯作用Eca-109细胞48h后,Eca-109细胞中Survivin蛋白表达荧光指数(FI值)分别为1.000±0.000、0.855±0.009、0.689±0.017、0.313±0.034,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(p<0.05),以40μg/mlVES对Survivin抑制最显著。Eca-109细胞中Caspase-3蛋白表达荧光指数(FI值)分别为1.000±0.000、1.354±0.092、1.604±0.078、1.757±0.084,比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(p<0.05),以40μg/mlVES对Caspase-3上调最显著。采用Spearman等级相关分析显示:Survivin的表达与Caspase-3的表达呈负相关(r=-0.953, p<0.05),散点图如Fig.11所示。结论:1本实验证实在一定浓度范围内,维生素E琥珀酸酯具有抑制人食管癌细胞Eca-109增殖的作用,并呈浓度-时间依赖关系。2维生素E琥珀酸酯抑制人食管癌细胞Eca-109增殖通过诱导该细胞凋亡实现。3维生素E琥珀酸酯可能通过下调Survivin蛋白和上调Caspase-3蛋白表达水平而发挥其抑制食管癌细胞Eca-109增殖、诱导凋亡的作用,且Survivin表达与Caspase-3蛋白表达呈负相关。