【摘 要】
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目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒。方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18
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目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒。方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入SacⅠ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定。再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定。所构建的重组质粒转化JM109, IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定。结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同。所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kDa蛋白,经Western blot鉴定系EWS-FLI1蛋白。结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
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