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新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,Co VID-19）自暴发以来已经席卷了全球200多个国家和地区,是目前世界上最大的公共卫生威胁。该病是由新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-Co V-2）引起的一种烈性、传染性较强的人兽共患病。尽管全球已有多种获批上市的COVID-19疫苗,仍然有越来越多的人由于病毒变异被感染并出现不同程度的临床症状。因此,开发有效的预防和治疗药物迫在眉睫。SARS-Co V-2棘突蛋白（S）受体结合域（Receptor-Binding Domain,RBD）作为结合受体细胞的关键靶点,一直是抗体药物研发的主要靶点。目前关于抗SARS-Co V-2单克隆抗体的研究较多,主要为利用噬菌体展示、流式细胞术分选等技术获得中和性抗体。单链抗体（Single Chain Antibody Fragment,sc Fv）作为小分子抗体的代表性药物,具有研发周期短、生产成本低、易于基因工程操作和半衰期短等优点。双特异性抗体（Bispecific Antibody,Bs Ab）兼具了单分子策略和鸡尾酒疗法的特点,可通过不同的抗原结合臂同时结合两个不同的抗原表位,具有单克隆抗体难以比拟的优势。因此,本研究以SARS-Co V-2 RBD为靶点,展开了抗SARS-Co V-2单链抗体和双特异性单链抗体的研究。目的:利用从新冠肺炎和非典型肺炎康复者血清中筛选得到的中和性抗体COVA1-16、COVA2-29和CR3022,开发抗SARS-Co V-2单链抗体和双特异性抗体形式的抗体。优化各抗体分子的生产工艺,研究其对SARS-Co V-2 RBD的结合活性以及对新冠病毒的中和活性。研究作为抗体鸡尾酒组分或双特异性抗体亚基的S3022与其他单链抗体的协同作用。利用生物信息学方法分析各单链抗体与SARS-Co V-2 RBD作用的不同抗原表位并验证预测结果。内容:利用从新冠肺炎和非典型肺炎康复者血清中筛选得到的中和性抗体COVA1-16、COVA2-29和CR3022,通过原核表达系统,开发单链抗体S1-16、S2-29和S3022以及双特异性抗体形式的双特异性单链抗体16-29、16-3022。对各抗体分子的诱导表达、纯化以及复性工艺进行优化。对每个抗体分子与SARS-Co V-2RBD的结合活性进行鉴定,并对每个抗体分子和抗体鸡尾酒对新冠病毒的中和活性进行评价。利用生物信息学方法,对三种单链抗体进行结合SARS-Co V-2 RBD的抗原表位研究,探究S3022是否可以与其他靶向SARS-Co V-2 RBD抗体发挥协同作用,增强其中和活性。方法:利用大肠杆菌BL21工程菌原核表达五种抗SARS-Co V-2单链抗体及双特异性单链抗体,包涵体溶解后利用金属螯合层析进行纯化,利用透析复性法获取目的抗体。利用ELISA和Western blot方法鉴定五种抗体与SARS-Co V-2 RBD的结合活性。利用SPR方法计算五种抗体与SARS-Co V-2 RBD结合的平衡解离常数。利用MTT方法鉴定五种抗体的细胞毒性。利用假病毒中和试验评价五种抗体及抗体鸡尾酒对新冠假病毒的中和活性。利用活毒抑制实验评价双特异性抗体16-3022与抗体鸡尾酒对新冠活病毒的中和作用。利用同源建模在线平台与Discovery Studio 2016 Client软件模拟三种单链抗体与SARS-Co V-2 RBD的结合,并用竞争ELISA方法进行单链抗体结合SARS-Co V-2 RBD的抗原表位分析。结果:五种抗体均为包涵体表达,包涵体通过金属螯合层析纯化,透析复性后获得了纯度90%以上的目的蛋白。ELISA结果显示,五种抗体均与SARS-Co V-2RBD有较高的亲和力,其中双特异性抗体的结合力较单链抗体提升了4～8倍,Western blot结果与ELISA结果一致。MTT结果显示五种抗体在0～10μM的浓度范围内对Vero细胞均无细胞毒性。假病毒中和结果显示双特异性抗体以及抗体鸡尾酒较单链抗体大大提升了对新冠假病毒的中和能力,其中双特异性抗体16-3022的IC90低于43 n M,为单链抗体S1-16和S3022 IC90的192倍以上。Q-PCR结果显示16-3022和抗体鸡尾酒在10μM浓度下即可有效抑制新冠病毒基因组复制,其中16-3022可使病毒基因组拷贝数降低58倍。分子对接结果显示三种单链抗体分别与SARS-Co V-2 RBD不同的区域结合,竞争ELISA结果与分子对接结果一致。结论:1.利用原核表达系统,成功表达并评价了对新冠病毒有较高的亲和力和中和活性的双特异性单链抗体。2..预测并验证了三种单链抗体与SARS-Co V-2 RBD结合的抗原表位并不完全重合,单链抗体S3022可以和其他靶向SARS-Co V-2 RBD的抗体发挥协同作用提升中和活性,为后续针对SARS-Co V-2的抗体研发提供了新的思路。