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膜联蛋白I(Annexin I, Anxa-1)是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,是首先被发现并被研究的膜联蛋白超家族成员。Anxa-1含有4个保守结构域,在物种间的进化中比较保守。它与细胞的炎症反应、分化、增殖、死亡、清除凋亡细胞等许多重要的细胞生命活动密切相关。Anxa-1的表达失调也与肿瘤的发生、发展有关联,并且其在不同器官肿瘤细胞中表达水平具有差异性。在鹿茸尖端组织中鹿茸细胞增殖速度比癌细胞增殖速度还要快,尽管鹿茸角生长速度惊人,但却没有癌变,所以鹿茸组织也是研究哺乳动物细胞快速增殖发育的理想模型。 本研究设计了Anxa-1基因特异性引物,以梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA为模板,PCR扩增梅花鹿 Anxa-1基因序列,与 pMD-18T载体连接,转化到DH5α细胞中。菌液经PCR鉴定、测序鉴定和质粒双酶切鉴定。测序结果在NCBI上分析,发现 Anxa-1基因开放阅读框大小是1041bp,其编码氨基酸大小为346个,与曲昊淼获得的基因序列一致。将含有双酶切位点的 Anxa-1基因片段与同样经过双酶切的真核表达载体 pEGFP-C1连接,转化到 DH5α细胞中,进行 PCR鉴定分析,结果表明成功构建了梅花鹿 pEGFP-C1-Anxa-1真核表达载体。将其瞬时转染到293T细胞中,24h后在荧光显微镜下观察细胞,可以观察到绿色荧光,通过 Real-time PCR检测,Anxa-1在实验组的表达量是对照组的200多倍,说明 pEGFP-C1-Anxa-1真核表达载体在293T细胞里成功表达。Real-time PCR检测与Anxa-1相关的调控细胞生长发育的β-catenin基因、TGF-β1基因和 Pdgfa基因的相对表达量。发现Anxa-1基因的高表达时,会显著的下调β-catenin基因的表达量((P<0.05),TGF-β1基因会显著(P<0.01)上升,而Pdgfa基因的表达量没有明显的变化。