猪肉是中国人膳食中主要的动物蛋白质来源,从古至今,猪肉一直是中国人消费的主要肉类,因此猪肉在国民经济中十分重要。脂肪组织是猪胴体的重要组成部分之一,目前对猪肉中脂肪组织的研究主要集中在两大部分,一部分是猪的皮下脂肪,与品种、生产效率、饲料报酬等相关,另一部分肌内脂肪,决定其含量的条件十分复杂,影响着猪肉的品质,因此研究脂肪组织形成的调控机制对于提升猪肉的品质至关重要。脂肪组织中的脂解作用是影响脂肪沉积的一种关键方式。脂解作用是由许多脂肪酶调控的,ATGL(脂肪酸甘油三酯水解酶)基因是脂解的起始酶,有报道称敲除ATGL导致小鼠骨骼肌中的肌内脂肪含量增加,并且不损害肌肉的线粒体功能,因此ATGL基因可能是猪肌内脂肪沉积调控的优质基因靶标,然而猪ATGL基因对肌内脂肪的沉积和其上游转录机制目前尚未研究透彻。本研究成功克隆了猪ATGL基因的启动子,通过在线软件预测及构建系列截短的报告载体筛选出对猪ATGL启动子活性有影响的转录因子p53,并在活体水平和细胞水平验证了p53对ATGL基因表达的影响。获得主要结果如下:1.成功扩增了猪ATGL基因上游3156bp的片段,将片段构建p GL3.0-basic载体,双荧光素酶报告基因显示该片段具有转录活性。通过同源重组构建分割的p GL3.0启动子载体,结合5’RACE扩增的结果,明确ATGL的核心启动子位于起始密码子-220到+40区域。在线软件JASPAR和Alggen Promo预测出该区域存在保守的p53结合位点,突变该位点后ATGL启动子的转录活性显著降低,表明p53可能结合ATGL启动子并促进ATGL转录。2.使用p53天然小分子激活剂Triptolide处理成脂分化6d的猪原代皮下脂肪细胞,p53的表达升高,脂解相关标志基因ATGL、HSL显著升高,油红O染色和Bodipy染色表明细胞中的脂质沉积显著减少,而细胞外培养基中甘油三酯和游离脂肪酸的含量显著上升,说明p53的天然激活剂Triptolide能够增强猪脂肪细胞的脂解能力。Triptolide处理3T3-L1细胞系取得了类似的结果,表明p53活化后促进ATGL基因转录并促进脂肪分解。3.构建高脂日粮饲喂的肥胖小鼠模型,腹腔注射p53激活剂Triptolide,生理盐水作为对照组。长期处理组(7周)的小鼠组织切片显示皮下脂肪和性腺脂肪细胞显著变少,q RT-PCR和WB的结果表明脂解标志基因ATGL、HSL等的表达显著升高,表明p53同样能够在小鼠活体水平上增强ATGL转录。短期处理组(24h)的小鼠脂肪组织和肝脏中的p53和ATGL基因的表达量都是显著上升,说明ATGL在p53激活后表达水平呈正相关。4.p53激活剂Triptolide处理体外培养的猪原代皮下脂肪细胞和3T3-L1细胞系,染色质免疫共沉淀技术验证了p53与ATGL启动子结合,并且Triptolide处理显著升高了p53与ATGL启动子的结合。综上所述,本研究成功克隆了猪ATGL基因的启动子,并筛选出一个全新的保守的ATGL转录激活因子——p53,丰富了猪脂解作用的上游调控网络,为猪肉品质遗传改良提供了新的理论依据。