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研究背景心肌肥厚有两种类型:生理性肥厚和病理性肥厚。生理性肥厚常见于运动员和妊娠等,一般不会进展为心力衰竭,但病理性肥厚通常会进展为心力衰竭。目前的研究表明高血压、瓣膜性心脏病、冠心病以及遗传性心肌病等是引起病理性心肌肥厚的主要原因。病理性心肌肥厚导致心力衰竭的治疗策略包括药物治疗（β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、醛固酮受体抑制剂、伊伐布雷定和左西孟旦等）和器械治疗（心脏再同步化治疗和植入型心律转复除颤器等）。虽然心力衰竭患者的症状以得到了很大的改善,但其死亡率仍居高不下。病理性心肌肥厚的发病机制十分复杂,至今仍未完全明确。因此,阐明病理性心肌肥厚的发生机制,延缓和逆转其向心力衰竭的发展,寻找新的治疗靶点,具有非常重要的临床意义及社会价值。由于心肌细胞为终末分化细胞,心肌肥厚的实质是心肌中蛋白质含量的增加。蛋白质质量控制的失衡导致蛋白质稳态被破坏,和多种疾病相关。心脏压力负荷增加导致心肌肥厚,伴随心脏中蛋白质的周期性生成、降解和氧化损伤。研究表明,在病理性心肌肥厚和心力衰竭的心脏中,存在大量的泛素化蛋白。泛素化修饰在调节心肌细胞蛋白代谢的动态平衡和心肌细胞的正常功能中起着极其重要的作用。环指蛋白5（Ring-finger protein 5,RNF5）是一种E3泛素连接酶,是泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system,UPS）的主要组成成分之一,参与多种蛋白底物的降解。既往研究表明,在病毒感染条件下,RNF5可泛素化并降解干扰素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes,STING）,从而减少I型干扰素的产生。在病理性心肌肥厚中,STING的缺乏可改善心肌炎症反应和纤维化程度。然而,目前关于RNF5的研究多集中于炎症反应、先天性免疫反应和恶性肿瘤等方面,RNF5在病理性心肌肥厚中是否发挥作用,以及该作用是否通过STING产生尚无报道。因此,本研究旨在探究RNF5在病理性心肌肥厚中的作用及其相关分子机制,寻找病理性心肌肥厚新的有前景意义的治疗靶点。第一部分 RNF5在病理性心肌肥厚中表达增加目的通过构建病理性心肌肥厚的细胞模型和动物模型,探讨RNF5在病理性心肌肥厚中是否存在差异性表达。方法（1）应用去氧肾上腺素（Phenylephrine,PE）诱导新生大鼠心肌细胞（Neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）构建心肌细胞肥大模型,磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）处理的NRCMs作为对照组。（2）构建主动脉弓缩窄（Transverse aortic constriction,TAC）诱导的病理性心肌肥厚小鼠模型,假手术处理的小鼠作为对照组。（3）免疫荧光检测NRCMs细胞形态变化。（4）RT-PCR和Western blot分别检测NRCMs和小鼠心肌组织中RNF5和心肌肥厚生物标志物心房利钠肽（Atrial natriuretic peptide,ANP）、脑钠肽（Brain natriuretic peptide,BNP）和 β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,MYH7）基因的mRNA和蛋白表达水平。结果（1）与PBS对照组相比,在PE诱导的NRCMs肥大模型中,免疫荧光显示PE刺激可使NRCMs肥大,提示造模成功;RT-PCR显示Rnf5的mRNA表达无明显差异;Western blot显示RNF5的蛋白表达显著增加。（2）与假手术组相比,在TAC诱导的病理性心肌肥厚小鼠模型中,RT-PCR显示心肌组织中Rnf5的mRNA表达无明显差异;Western blot显示RNF5的蛋白表达显著增加。结论RNF5在肥大的心肌细胞和病理性心肌肥厚模型小鼠的心肌组织中蛋白表达增加。第二部分 RNF5对病理性心肌肥厚的影响目的通过构建RNF5基因敲除小鼠,RNF5敲低和RNF5过表达的NRCMs模型,分别从体内实验和体外实验探究干预RNF5对病理性心肌肥厚的影响。方法（1）构建TAC诱导的心肌肥厚小鼠模型,术前将小鼠随机分为4组:野生型+假手术组（WT Sham）,野生型+TAC组（WT TAC）,RNF5基因敲除+假手术组（KO Sham）和RNF5基因敲除+TAC组（KO TAC）。（2）分别对小鼠体重、心脏重量、肺重量和胫骨长度进行称量。（3）小动物超声评估心功能。（4）H＆E和麦胚凝集素（WGA）染色评估心肌细胞的肥大程度。（5）RT-PCR和Western blot分别检测心肌肥厚生物标志物（ANP、BNP和MYH7）的表达。（6）天狼猩红（PSR）染色评估心肌间质纤维化。RT-PCR和Western blot分别检测纤维化标志物胶原Ⅰ α1（Collagen Ⅰα1）、胶原Ⅲ α1（Collagen Ⅲ α1）和结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）的表达水平。（7）RT-PCR检测炎症因子白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的mRNA表达水平。Western blot检测核转录因子κB（NF-κB）信号通路中相关蛋白的表达水平。（8）体外实验中,应用含短发夹RNA的腺病毒（AdshRNF5）感染NRCMs敲低RNF5,然后用PE诱导心肌细胞肥大模型,感染前将细胞随机分为四组:AdshRNA PBS,AdshRNF5 PBS,AdshRNA PE 和 AdshRNF5 PE。另外,应用RNF5过表达的腺病毒（AdFlag-RNF5）感染NRCMs,感染前将细胞随机分为四组:AdVector PBS,AdFlag-RNF5 PBS,AdVector PE 和 AdFlag-RNF5 PE。（9）RT-PCR和 Western blot 分别检测上述细胞中 RNF5、ANP、BNP和MYH7的mRNA和蛋白表达水平。（10）免疫荧光检测干预RNF5后心肌细胞大小。结果（1）大体标本显示,和WTTAC组相比,RNF5敲除使TAC诱导的心肌肥厚模型小鼠的心脏重量、心脏重量/体重、肺脏重量/体重和心脏重量/胫骨长度的比值显著增加。（2）心脏超声结果显示,RNF5敲除使TAC诱导的心肌肥厚模型小鼠的左心室舒张末期内径（Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd）和左心室收缩末期内径（Left ventricular end-systolic diameter,LVESd）显著增加,射血分数（Ejectionfraction,EF）和短轴缩短率（Fractional shortening,FS）显著下降。（3）H＆E和WGA染色结果显示,RNF5敲除使TAC诱导的心肌肥厚小鼠的心肌横截面积显著增加。（4）RT-PCR和Western blot显示RNF5的缺失使TAC诱导的心肌肥厚模型小鼠的ANP、BNP和MYH7的表达显著增加。（5）PSR染色显示,RNF5敲除使TAC诱导的心肌肥厚模型小鼠心肌间质胶原沉积增加和血管周围纤维化加重,并使纤维化标志物（Collagen Ⅰα1、Collagen Ⅲα1 和 CTGF）的表达增加。（6）RT-PCR显示Rnf5敲除使TAC诱导的心肌肥厚模型小鼠的炎症因子（Il-6、Il1-β和Tnf-α）mRNA的表达增加,Western blot结果显示NF-κB通路中p-IKKβ、p-IkBα和p-p65的蛋白表达增加。（7）体外实验中,在RNF5敲低的NRCMs中,免疫荧光显示RNF5敲低使PE诱导的NRCMs的表面积显著增加,RT-PCR和Western blot显示RNF5敲低使ANP、BNP和MYH7的表达显著增加;在RNF5过表达的NRCMs中,免疫荧光显示RNF5过表达使PE诱导的NRCMs的表面积显著减少,RT-PCR和Western blot显示RNF5过表达使ANP、BNP和MYH7的表达显著下降。结论RNF5敲除加重了 TAC模型小鼠的心肌肥厚,相应的细胞模型中,RNF5敲低促进PE诱导的NRCMs发生肥大,而RNF5过表达可改善PE诱导的NRCMs的肥大。第三部分 RNF5在病理性心肌肥厚中的作用机制目的探究RNF5在病理性心肌肥厚中的具体分子机制。方法（1）对WTTAC和KO TAC小鼠心肌组织进行mRNA-Seq分析,探究RNF5缺失对心肌肥厚转录组水平的影响。（2）质谱分析筛选与RNF5相互结合的蛋白。（3）免疫荧光探究RNF5和STING两种蛋白在细胞中的定位情况。（4）蛋白互作验证RNF5和STING是否发生相互作用。（5）泛素化实验探究RNF5是否通过泛素化调控STING,以及泛素化的类型及泛素化位点。（6）挽救实验进一步证实RNF5调控STING在心肌肥厚中的作用。结果（1）mRNA-Seq分析结果显示,RNF5敲除小鼠心肌组织中炎症反应、纤维化和心肌功能信号通路相关基因的表达显著上调。（2）质谱分析提示STING为与RNF5结合的蛋白。（3）免疫荧光显示RNF5和STING共定位于细胞质中。（4）蛋白互作证实RNF5和STING存在直接相互作用。（5）泛素化实验表明RNF5通过K48连接的多聚泛素链泛素化STING导致其降解。（6）挽救实验证实RNF5通过泛素化STING导致其降解来缓解病理性心肌肥厚。结论RNF5通过K48连接的多聚泛素化促进STING的降解来缓解病理性心肌肥厚。