论文部分内容阅读
研究背景肺癌为我国死亡率最高的恶性肿瘤,随着低剂量螺旋CT广泛应用,肺癌的死亡率虽然有所降低,但随着越来越多的肺部结节患者被发现,肺部结节的良恶性鉴别诊断成为亟待解决的临床问题。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）为肺癌的主要类型,占80%。因此,对NSCLC与良性肺部结节（benign pulmonary nodules,BPNs）的准确鉴别,可指导临床对肺部结节患者进行有效管理、治疗,促进医疗资源合理分配,降低肺癌死亡率。CT检测肺癌存在较高的假阳性率,可通过结合生物标志物构建NSCLC与BPNs诊断模型,来降低其假阳性率。mi RNA能够稳定存在于血清中,受血清反复冻融、p H变化等影响较小,是具有广阔应用前景的血清标志物。研究目的本研究旨在筛选出在NSCLC患者血清中高表达的mi RNAs,并发现对NSCLC和BPNs具有鉴别诊断价值的新型血清mi RNAs,进而结合CT指标和临床信息构建NSCLC与BPNs鉴别诊断模型,为NSCLC的早期诊断提供新的策略;并对具有良好鉴别诊断价值的mi R-4687-3p在NSCLC中的功能及机制进行探索,为NSCLC的发生发展机制提供新的理论基础。实验方法第一部分NSCLC与BPNs血清差异mi RNAs的筛选及验证1.收集患者血清496例,分为筛选组、确认组和验证组。筛选组30例,包括NSCLC 10例,BPNs 10例,健康对照10例;确认组110例,包括NSCLC 55例,BPNs 55例;验证组356例,包括NSCLC 196例,BPNs 160例。2.通过高通量mi RNA芯片筛选获得NSCLC与健康对照血清差异mi RNAs及NSCLC与BPNs血清差异mi RNAs;应用q RT-PCR针对确认组和验证组NSCLC与BPNs血清对差异mi RNAs进行检测。应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析各差异表达的mi RNAs对NSCLC与BPNs的鉴别诊断价值。同时针对验证组,对血清差异mi RNAs在不同临床特征亚组中NSCLC与BPNs的表达水平进行分析并对其鉴别诊断NSCLC与BPNs价值进行评价。第二部分基于血清mi RNAs的NSCLC与BPNs鉴别诊断模型的构建与评价1.筛选出第一部分所纳入样本中具有完整病历信息、CT影像特征、血清CEA及CYFRA21-1检测结果的NSCLC 163例,BPNs 160例。样本根据收集时间排序,按3:1比例分为训练组和测试组,其中训练组245例,包括NSCLC 112例,BPNs 133例;测试组78例,包括NSCLC 51例,BPNs 27例。2.基于训练组,对包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、家族肿瘤史、血清CEA、CYFRA21-1、mi R-4687-3p、mi R-4488、mi R-595、结节直径、数目、边缘、空洞征、毛刺征、血管切迹征、分叶征、棘突征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大、肺气肿、钙化在内的22个变量进行单因素分析,筛选在NSCLC与BPNs中差异表达的变量。3.针对从训练组中筛选出的差异有统计学意义的变量利用3种二元logistic回归方法（向前法、向后法、进入法）构建NSCLC与BPNs鉴别诊断模型,并在测试组中进行诊断价值验证;应用Delong检验评价各模型的稳定性,选出最优模型;分析最优logistic模型在各临床特征亚组中对NSCLC与BPNs的的鉴别诊断价值;对比logistic模型与已公开发表的梅奥（Mayo）模型及北大模型对NSCLC与BPNs的鉴别诊断价值;通过交互式列线图实现模型的可视化。第三部分mi R-4687-3p对NSCLC细胞功能的影响及机制初探1.基于TCGA数据库,比较mi R-4687-3p在肺腺癌及肺鳞癌和正常肺组织中的表达水平;通过在线数据库对mi R-4687-3p的靶基因进行预测,并对预测的靶基因进行GO和KEGG富集分析、比较其在NSCLC组织及正常对照肺组织中m RNA的表达水平、及其m RNA表达水平与NSCLC患者生存时间的关系。2.应用q RT-PCR检测NSCLC细胞中mi R-4687-3p和硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting proteins,TXNIP）m RNA的表达水平。3.应用双荧光素酶报告实验验证TXNIP 3’-非编码区（untranslated region,UTR）与mi R-4687-3p的结合情况。4.利用瞬时转染和/或应用慢病毒转染构建过表达稳转细胞株,检测mi R-4687-3p对NSCLC细胞恶性表型的影响及TXNIP对mi R-4687-3p功能回复作用。5.应用CCK-8、Transwell侵袭及迁移实验、TUNEL实验检测NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡能力的改变。6.应用细胞免疫荧光检测NSCLC细胞内TXNIP蛋白表达水平。7.应用活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒检测NSCLC细胞内ROS表达水平的变化。8.构建裸鼠皮下荷瘤模型（NC组,mi R-4687-3p组,mi R-4687-3p+TXNIP组）,监测裸鼠肿瘤体积并绘制生长曲线。9.应用免疫组化检测荷瘤裸鼠组织内Ki-67蛋白表达情况。研究结果第一部分NSCLC与BPNs血清差异mi RNAs的筛选及验证1.经芯片筛选,共得到13个在NSCLC血清中高表达的mi RNAs,其中6个血清mi RNAs在NSCLC中表达量高于健康对照;7个血清mi RNAs在NSCLC中的表达水平高于BPNs。2.经确认组、验证组检测,mi R-4687-3p、mi R-4488、mi R-595在NSCLC血清中的表达水平显著高于BPNs,其中,mi R-4687-3p在验证组中的诊断AUC（95%CI）最大,为0.694（0.640-0.749）。3.针对验证组数据进行亚组分析,血清mi R-4687-3p、mi R-595、mi R-4488可有效鉴别CEA（-）、CYFRA21-1（-）亚组中的NSCLC与BPNs,诊断AUC范围为0.610-0.730;血清mi R-4687-3p及mi R-4488可有效鉴别早期NSCLC与BPNs,诊断AUC（95%CI）分别为0.696（0.629-0.763）、0.646（0.579-0.713）。第二部分基于血清mi RNAs的NSCLC与BPNs鉴别诊断模型的构建与评价1.针对22个变量进行单因素分析,其中14个变量（年龄、mi R-4687-3p、mi R-4488、mi R-595、CEA、CYFRA21-1、结节直径、数目、毛刺征、分叶征、血管切迹征、胸膜凹陷征、纵膈淋巴结肿大、钙化）在NSCLC与BPNs患者之间均存在显著差异。2.经Delong检验,logistic回归（向前法）模型（纳入变量包括年龄、mi R-4687-3p、CYFRA21-1、结节数目、血管切迹征、胸膜凹陷征、钙化）在训练组和测试组中对NSCLC与BPNs的鉴别诊断AUC较其它2种模型具有更强的稳定性（P=0.407）,为最优预测模型,其在训练组和测试组中诊断AUC（95%CI）、灵敏度、特异度分别为0.849（0.802-0.897）、67.9%、87.2%和0.802（0.702-0.902）、54.9%、85.2%。3.基于训练组的临床特征亚组分析,logistic模型对孤立性、实性、CEA（-）、CYFRA21-1（-）亚组中的NSCLC和BPNs具有良好的鉴别诊断价值,诊断AUC为0.784-0.849。对早期NSCLC与BPNs,logistic模型同样具有良好的鉴别诊断价值,AUC（95%CI）为0.800（0.725-0.874）4.本研究logistic回归模型较Mayo模型和北大模型具有更优的良恶性肺部结节鉴别诊断价值。通过对不同变量进行赋值,绘制交互式列线图,可以获得患者罹患NSCLC的概率,实现了模型的可视化。第三部分mi R-4687-3p对NSCLC细胞功能的影响及机制初探1.基于TCGA数据库肺腺癌及肺鳞癌mi RNAs表达量数据,发现mi R-4687-3p在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达均高于正常肺组织。2.与对照组相比,过表达mi R-4687-3p促进NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移;敲低mi R-4687-3p抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移,促进凋亡。3.通过预测,共筛选出11个mi R-4687-3p相关靶基因;经GEPIA网站验证发现TXNIP m RNA在肺腺癌和肺鳞癌的表达水平均低于正常肺组织;通过Kaplan-Meier Plotter在线网站分析发现,TXNIP m RNA高表达的患者较低表达患者总生存期长;双荧光素酶报告实验检测发现,mi R-4687-3p能够与TXNIP3’-UTR结合;q RT-PCR与细胞免疫荧光实验检测发现,敲低和过表达mi R-4687-3p可以负向调控NSCLC细胞系中TXNIP m RNA和蛋白的表达水平。4.敲低mi R-4687-3p,NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移能力显著减弱,凋亡水平增强,而同时敲低TXNIP可逆转mi R-4687-3p敲低对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用及对凋亡的促进作用;过表达mi R-4687-3p显著促进NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移,而同时过表达TXNIP后,可逆转过表达mi R-4687-3p对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移的促进作用。5.相较于对照组,过表达mi R-4687-3p能够促进裸鼠移植瘤的增殖,Ki-67表达水平较NC组明显增强,而同时过表达TXNIP则显著抑制过表达mi R-4687-3p对裸鼠肿瘤增殖和Ki-67表达的促进作用。6.敲低mi R-4687-3p促进NSCLC细胞内ROS的产生,而同时敲低TXNIP,逆转mi R-4687-3p敲低对NSCLC细胞内ROS产生的促进作用。结论1.血清mi R-4687-3p、mi R-4488、mi R-595在NSCLC中的表达水平高于BPNs,是NSCLC与BPNs鉴别诊断的潜在标志物。2.联合mi R-4687-3p、CYFRA21-1、年龄、结节数目、血管切迹征、胸膜凹陷征、钙化构建的logistic模型对NSCLC与BPNs具有较好的鉴别诊断价值。3.mi R-4687-3p通过靶向TXNIP促进NSCLC细胞的增殖、侵袭、迁移,抑制细胞凋亡。