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锰氧化物是普遍存在于深海、土壤和沉积物中的高反应活性矿物,锰平均氧化度的准确测定是了解其结构和特性,环境行为和潜在应用价值的重要前提。传统方法测定锰平均氧化度存在操作繁琐、分析周期长、对微量样品不太适用等缺点,而且每种方法都有一定的局限性。细菌氧化锰的反应是一个极其复杂的过程,目前认为多铜氧化酶的作用是催化形成锰氧化物的主要原因,但其催化氧化的机理并不是很清楚,锰氧化基因克隆表达纯化得到的重组蛋白,体外氧化Mn(Ⅱ)/Mn(Ⅲ)的特性更是急需探究。该机制的发现,将有助于我们更好的理解多铜氧化酶在生物成矿过程中的催化作用,对调控其氧化行为、影响重金属、有机污染物的迁移转化和地球化学循环过程具有重要的意义!本研究中,以草酸还原-高锰酸钾返滴定法和X射线吸收近边结构光谱(XANES)作为对照方法,利用新颖两步比色法对水羟锰矿、酸性水钠锰矿和黑锰矿进行锰平均氧化度的测定。接着探究将E.coli K-12 MG1655中cueO基因克隆外源表达、纯化出的重组蛋白CueO体外氧化Mn(Ⅱ)/Mn(Ⅲ)的特性及电子传递问题。在低锰离子、低铜离子浓度的体系中,借助DFOB捕获Mn(Ⅲ),分别定时监测以Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅲ)为反应物时,反应体系中Mn(Ⅲ)-DFOB及高价锰的含量变化。取得的主要结果如下:1.测定高价锰含量的LBB比色法和总锰含量的甲醛肟比色法结合得到的新颖两步比色法,测定水羟锰矿、黑锰矿和酸性水钠锰矿的锰平均氧化度分别是4.00±0.02、2.67±0.01和4.00±0.01,其准确度和精确度明显高于草酸–还原高锰酸钾返滴定法和XANES光谱法的测定结果,而且该方法对微量样品(0.005 g)十分适用。2.重组蛋白CueO在低锰低铜(2 mM MnCl2、0.4 mM CuCl2)体系下依然能够生成高价锰氧化物,排除了化学氧化的影响,进一步证实CueO蛋白在体外的锰氧化活性。同时,Na4P2O7溶液对CueO蛋白的锰氧化活性具有明显的抑制作用,且抑制作用随着浓度增加而加强,当加入高浓度Na4P2O7(5 mM)溶液能够完全抑制CueO蛋白的锰氧化活性。3.在重组蛋白CueO体外氧化Mn(Ⅱ)的特性探究中,定时监测Mn(Ⅱ)为反应物时体系中Mn(Ⅲ)-DFOB和高价锰的含量变化。结果表明,CueO蛋白可以氧化Mn(Ⅱ)生成Mn(Ⅲ),氧化效率高达50%,且DFOB的加入可以增强CueO蛋白对Mn(Ⅱ)的氧化。同时定时取样加入LBB后颜色无变化,表明体系中无Mn(Ⅳ)生成。4.在重组蛋白CueO体外氧化Mn(Ⅲ)的特性探究中,定时监测乙酸锰(C6H9MnO6)为反应物时体系中Mn(Ⅲ)-DFOB和高价锰的含量变化。结果表明,CueO蛋白的加入能够抑制Mn(Ⅲ)的还原消失。同时定时取样加入LBB后颜色无变化,表明CueO蛋白不能氧化Mn(Ⅲ)生成Mn(Ⅳ),因此CueO蛋白不能独自催化完成两步电子传递的锰氧化过程。