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第一部分LPS诱导人气道上皮细胞炎症反应中miR-223表达变化及对NF-κB活性的调控目的 本实验借助内毒素脂多糖（LPS）刺激体外培养的人气道上皮细胞来构建炎症反应的体外模型,检测miR-223及连环素p120（p120）表达变化及其对NF-κB信号通路的影响,初步探讨LPS所致气道炎症的分子机制。方法 根据本实验室前期研究及相关文献,采用CCK8检测不同浓度LPS（0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、100μg/ml及200μg/ml）对细胞活性的影响。根据CCK8结果,选取20μg/ml LPS作为刺激条件,采用Western Blot检测不同时间点p120、p-IKK、IKKα、p-IκB、IκBα、p-p65及NF-κB p65蛋白的表达变化,运用Real-time PCR检测p120 m RNA水平以及miR-223的表达情况。选取p120变化最明显的时间点6h作为LPS刺激时间,分别转染miR-223类似物、miR-223抑制物及各自阴性对照miRNA,采用ELISA或Real-time PCR检测NF-κB下游IL-1β、IL-6、IL-8以及COX-2的表达变化。采用Western Blot检测NF-κB通路中蛋白表达变化。采用核浆分离检测p65的入核情况及免疫荧光检测NF-κB p65表达及分布的改变。采用Real-time PCR检测p120 m RNA水平以及miR-223的表达情况。结果（1）CCK8结果显示,不同浓度的LPS刺激气道上皮细胞,作用不同时间均能轻微刺激细胞增殖,各组间差异无统计学意义（p>0.05）。（2）Western Blot检测发现20μg/ml LPS刺激16HBE可激活NF-κB通路,p-IKKα/β、p-IκBα及p-p65表达增高,IKKα及IκBα呈现先减少后升高的趋势。p120蛋白表达降低呈时间依赖性,Real Time PCR显示:miR-223在LPS刺激后表达上升,p120 m RNA表达下调。（3）将miR-223类似物、miR-223抑制物及各自阴性对照组转入16HBE细胞24h后给予LPS处理。RT-PCR检测发现,miR-223类似物转入细胞24h后再给予LPS刺激,NF-κB下游靶蛋白COX-2、IL-6及IL-8的胞内m RNA水平明显高于仅LPS刺激组（p<0.05）,转入miR-223抑制物后与LPS单一刺激无明显差异。（4）Western Blot实验发现,与仅LPS刺激组对比,转入miR-223类似物后的细胞p-IKKα/β、p-IκBα、p-p65表达增加更加明显。核浆分离实验证实miR-223可以促进p65的入核,免疫荧光检测显示p65在核内分布更多,ELISA检测NF-κB p65的磷酸化明显增高。（5）Western Blot及RT-PCR检测p120的表达,结果显示miR-223过表达使p120的蛋白水平及m RNA水平均降低（p<0.05）。结论 在LPS刺激诱导的气道炎症反应中,miR-223可能通过调控NF-κB通路,从而对炎症反应起到调节作用。第二部分LPS诱导人气道上皮细胞炎症反应中,miR-223调控NF-κB信号通路的可能分子机制目的在体外LPS刺激的气道上皮炎症反应模型中,改变miR-223及p120水平观测LPS刺激后p120及NF-κB信号通路中各蛋白表达的相应变化,进一步探讨气道炎症反应中miR-223调控NF-κB信号通路的可能分子机制。方法人气道上皮细胞16HBE细胞转入miR-223类似物或阴性对照,以及同时转入miR-223类似物、p120质粒1A或miR-223类似物、p120质粒3A组合,给予LPS刺激。采用ELISA检测IL-8的分泌,RT-PCR检测COX-2、IL-6、IL-8、p120的m RNA水平变化。采用免疫印记实验对细胞p120蛋白表达及NF-κB通路进行检测。采用免疫荧光实验检测细胞中p65的分布情况,ELISA实验检测NF-κB p65的磷酸化情况。转染不能与Rho A结合的p120DRDD质粒后,Western Blot检测细胞内Rho A表达情况,G-LISA检测细胞Rho A活性。结果（1）ELISA结果显示,同时转染miR-223类似物及p120质粒1A或者同时转染miR-223类似物及p120质粒3A,这两组与转染miR-223类似物后LPS刺激和仅LPS刺激组比较,IL-8分泌均呈现下降趋势,RT-PCR检测IL-8 m RNA具有同样的趋势,并且m RNA表达下降更明显,差异显著（p<0.05）。COX-2、IL-6的m RNA水平在转入p120质粒后均有下降。（2）Western Blot及RT-PCR结果显示,在转入p120质粒后细胞内p120蛋白及m RNA水平均明显升高。同时转染miR-223类似物及1A或者同时转染miR-223类似物及3A,这两组与转染miR-223类似物后LPS刺激和仅LPS刺激组比较,Western Blot检测发现p-p65表达明显下降,p120高表达时,miR-223促进NF-κB信号通路活化的作用受到部分抑制;（3）免疫荧光实验发现,转入p120质粒后,miR-223促进p65入核作用减弱。（4）ELISA结果显示,转入p120质粒后,miR-223促进NF-κB p65磷酸化的作用减弱。（5）G-LISA结果显示,转入miR-223及LPS刺激均使细胞内Rho A活性明显增加,转入p120质粒后Rho A活性下降。转入不能与Rho A结合的p120DRDD质粒后,抑制Rho A活性的作用消失。结论在气道炎症反应过程中,miR-223可能通过靶向负性调节p120的表达,增强Rho A活性,而实现对NF-κB信号通路的调控。