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斜带石斑鱼(EPinephelus coioides)，属鲈形目Pereiformes、鮨科Serranidae、石斑鱼亚科Epinephelinae、石斑鱼属Epinephelus，主要分布在沿海近礁水域，为雌性先熟的雌雄同体鱼类，是目前我国沿海地区重要的海水养殖经济鱼类。但目前对斜带石斑鱼生长发育及繁殖的内分泌调控机制缺乏深入系统的研究，石斑鱼在养殖过程中人工繁殖及促生长问题尚未得到很好的解决。本文根据已知斜带石斑鱼促性腺激素cDNA序列，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统对斜带石斑鱼促性腺激素进行体外重组，并对重组斜带石斑鱼促性腺激素(gonadotropin Hormone，GTH)的生物活性进行研究，以期对鱼类促性腺激素基因的结构与功能有进一步的了解，为开展鱼类促性腺激素的生理作用及作用机制研究打下基础，并为进一步研究石斑鱼生长和繁殖的神经内分泌调控机制提供理论依据。本研究的主要内容及结果如下：
1．采用RT-PCR法从斜带石斑鱼脑垂体克隆出促性腺激素GTHα、GTHIβ和GTH IIβ亚基并构建了斜带石斑鱼促性腺激素单个亚基cDNA转移质粒载体pFB-HT-A-GTH IIβ、pFB-l-GTH IIβ、pFB-HT-A-GTH Iβ、pFB-l-GTH Iβ、pFB-HT-A-GTHα、pFB-1-GTH α和双亚基pFB-GTH I和pFB-GFH Ⅱ共8种重组杆状病毒转移载体。pFastBac质粒是一种氨苄青霉素抗性供体质粒，含有杆状病毒特异性启动子与庆大霉素乙酰转移酶基因以及两个Tn7转座位点，需要表达的外源基因在多角体蛋白启动子作用下能够转染杆状病毒穿梭载体。采用特异性引物的多对组合对多个克隆进行了PCR鉴定，均出现了与预期值相符合的带。之后通过酶切以及DNA序列测定进行进一步鉴定。对四次PCR鉴定都为阳性的三个克隆进行多个组合的双酶切鉴定，结果均符合预期的酶切图谱；测序结果与GeneBank上登录的一致，氨基酸序列正确，表明斜带石斑鱼促性腺激素重组杆状病毒转移载体构建成功。
2．对上述8种斜带石斑鱼促性腺激素重组杆状病毒转移载体进行转座反应，并得到相对应的杆状病毒穿梭质粒载体(Bacmid)。Baemid是大肠杆菌DH10BAe的一个大质粒(136Kb)，含有Tn7靶位点mini-attTn7和卡那霉素抗性基因。重组的质粒转染大肠杆菌DH10BAc感受态细胞时，在含有四环素抗性基因和转座酶基因的助质粒的协助下，pFastBac质粒与Bacmid发生位点专一性转座，之后通过蓝白斑筛选转化子，分离制备高纯度Bacmid DNA。对阳性克隆通过PCR验证，实验结果与预期值符合。Southern杂交中重组Bacmid DNA呈杂交阳性，说明转座反应成功。
3．在Sf-9昆虫细胞中表达重组了斜带石斑鱼促性腺激素。于28℃培养昆虫细胞Sf-9至对数生长期，利用Cellfectin混合高纯度Bacmid DNA共转染昆虫细胞Sf-9，获得重组病毒。继续感染昆虫细胞2-3轮，可获得高滴度重组病毒。以适量重组病毒感染昆虫细胞Sf-9，利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中表达相应的重组蛋白，其表达量随时间增加而增强，存在时间梯度。SDS-PAGE、PAGE以及Western Blot分析鉴定重组蛋白表达正确。蛋白电泳分析结果表明重组蛋白表达量占细胞可溶性蛋白质的15％左右。
4．采用性腺静态孵育，放射免疫测定方法检测重组斜带石斑鱼促性腺激素的生理活性，结果表明重组蛋白对性类固醇激素(testosterone(T)、17β-estradiol(E<,2>))的分泌有明显的促进作用。斜带石斑鱼性腺组织碎片放于M199孵育液中预孵育18-24小时后，加入不同浓度的重组蛋白(0.5，2.5，5和10μg)和hCG(1，10，100和1 000 IU)，在孵育2,6,12和24小时取孵育液离心测定性类固醇激素(T、E<,2>)的含量。其中2.5μg GTHⅡ、GTH Ⅰ、GTH Ⅱβ、GTH Ⅰβ处理组在浓度上表现出效果最好，因此可以推定其为最佳浓度；在处理时间上，12作用效果依次为GTH Ⅰ、GTHⅡ、GTHⅠβ和GTHⅡβ，而GTH。
5．利用在体实验，腹腔注射不同浓度的重组斜带石斑鱼促GTHI、GTH IIβ、GTH Iβ(5×10<-3>，5×10<-2>和5×10<-1>μg／bw·g))和hCG(0.1，1和10 I／bwg)，18小时后尾静脉取血4℃离心用于性类固醇激素(T、E<,2>)的测定，其中取脑垂体、下丘脑和性腺组织用于测定GnRH、P450aromA、P450aromB、GTH Iβ、GTH IIβ和GTHα mRNA水平。实验结果表明，注射重组蛋白后，能够促进斜 带石斑鱼血清中性类固醇激素(T、E<,2>)分泌增加，同时P450aromA、P450aromB、GTH Iβ、GTH IIβ和GTHα mRNA表达水平升高，而GnPd mRNA表达水平下降。 其中重组斜带石斑鱼GTH II、GTH I、GTH IIβ、GTH Iβ在促进性类固醇激素(T、E<,2>)分泌上随着浓度的增加而增强，在相同浓度条件下，GTH I表现出的作用效果最好。
综上所述，本文利用杆状病毒在昆虫细胞内成功表达了斜带石斑鱼促性腺激素并对其进行了生物活性研究。本文的研究结果证明重组促性腺激素具有生物活性，可以促进斜带石斑鱼性类固醇激素的分泌以及引起基因表达水平的改变，并可为以后深入研究斜带石斑鱼生长、繁育以及促性腺激素作用机制和内分泌调控等方面提供物质基础。