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研究背景及目的:肝纤维化是肝脏在药物、病毒或缺血再灌注等病因刺激下发生的一种可逆的损伤修复反应,其特征在于肝损伤后引发的细胞外基质的积累。肝纤维化是许多慢性肝脏疾病共同的病理基础,持续进展的肝纤维化最终可能会导致肝硬化、肝衰竭、门脉高压甚至肝癌等,常常需要接受肝移植治疗。慢性病毒性肝炎、毒素、药物作用、胆汁淤积、营养缺乏、酒精滥用导致的酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病均可能导致肝纤维化的发生,但是具体的细胞生物学过程和潜在的分子机制仍需进一步阐明,靶向其中关键的调控分子和干预靶标,可为肝纤维化及其相关终末期肝病的防治提供新的思路和策略。肝脏内持续慢性炎症微环境被认为是肝纤维化、肝硬化甚至肝癌发生的重要原因之一。在药物毒性、病毒感染等情况下,肝细胞死亡和代偿性增殖反复出现,肝脏发生慢性炎症,该过程中往往伴随内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER-Stress)。细胞的内质网主要负责蛋白质的合成加工与分泌,正常情况下内质网中保持着一定的稳态,当细胞中的未折叠或错误折叠蛋白累积过多,超过内质网的处理能力时就会启动内质网应激。促进特定的蛋白合成以应对应激,同时减少一般的蛋白质合成。既往研究发现内质网应激中最主要的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)激活的三条主要的信号通路是IRE1(inositol-requiring enzyme 1),PERK-e IF2α-ATF4-CHOP和ATF6。通过UPR反应,细胞经由自噬降解蛋白质并清除未折叠蛋白,恢复平衡的稳态。ATF4(转录激活因子4)分子属于ATF/CREB(转录激活因子/环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白)家族,是一个碱性区域亮氨酸拉链(b Zip)转录因子,其入核后可通过诱导调节UPR的基因表达来参与调控未折叠蛋白反应和内质网应激,并且其上游的e IF2α还能够被除PERK之外的调控分子磷酸化激活,参与病毒感染、氨基酸缺乏、贫血等病理过程的调控;同时ATF4还广泛参与包括恶性肿瘤在内的多种复杂疾病发病过程。所以ATF4及其调控的靶基因在肝纤维化和肝癌发生中的作用值得深入研究。本课题将会通过ATF4敲除小鼠模型,体外细胞模型和临床肝癌样本三个层面开展研究,积极探究ATF4及其下游分子在肝纤维化和肝癌发生中的动态变化,旨在阐明内质网应激及其相关信号通路在肝纤维化中的调控作用,评估ATF4作为肝癌预后判断分子标志物的价值。在肝纤维化病理基础上发展而来的肝癌是导致肝病患者死亡的主要原因之一。肝癌早期诊断率低,病情进展快,一般患者发现时已经进展到晚期,晚期肝癌患者只有6个月的中位生存时间。肝细胞癌是一种预后极差的肿瘤,5年内复发率高达70%。虽然针对肝癌发生发展已有大量研究,但是由于肝癌的高度异质性,现有的分型体系无法实现对肝癌的有效分型和个体化治疗,因此,研究肝细胞癌相关的信号通路对深入探究肝细胞癌的发病原因,筛选和鉴定肝癌诊断和分型的标志物,以及开发新的治疗方案等有重要理论和现实意义。研究方案和技术方法:1.应用Real-time PCR、Western Blot和琼脂糖凝胶电泳等方法鉴定ATF4敲除小鼠的基因型,验证实验所使用的转基因小鼠中ATF4基因敲除效果。2.在ATF4全身敲除(纯合子、杂合子及野生型)C57BL/6小鼠上,通过腹腔注射5%的CCL4试剂建立肝纤维化模型,再应用Real-time PCR、Western Blot和免疫组织化学染色(IHC)的方法检测肝纤维化过程中相关分子的变化。3.利用ATF4全身敲除小鼠纯合子、杂合子及野生型C57BL/6小鼠分别建立腹腔注射5%CCL4诱导肝纤维化模型,应用Real-time PCR、Western Blot和免疫组织化学(IHC)方法检测肝纤维化过程中ATF4分子及其他内质网应激相关分子的变化。4.利用ATF4全身敲除小鼠纯合子、杂合子及野生型C57BL/6小鼠分别建立腹腔注射5%CCL4诱导肝纤维化模型,应用免疫组织化学(IHC)方法检测肝纤维化过程中细胞增殖相关分子的变化。5.利用ATF4全身敲除小鼠纯合子、杂合子及野生型C57BL/6小鼠分别建立腹腔注射5%CCL4诱导肝纤维化模型,应用TUNEL试剂盒测定肝纤维化过程中ATF4分子对细胞凋亡的影响情况。6.利用ATF4全身敲除小鼠纯合子、杂合子及野生型C57BL/6小鼠分别建立腹腔注射5%CCL4诱导肝纤维化模型,利用血液生化分析仪器检测各组小鼠血液中AST、ALT含量,评价ATF4敲除后肝细胞损伤程度的差异。7.利用ATF4全身敲除杂合子小鼠与野生型C57BL/6小鼠分别建立胆管结扎(BDL)诱导肝纤维化模型,应用Real-time PCR、Western Blot和免疫组织化学(IHC)方法检测BDL诱导肝纤维化过程中ATF4分子及其他内质网应激相关分子的变化。8.利用ATF4全身敲除杂合子小鼠与野生型C57BL/6小鼠分别建立胆管结扎(BDL)诱导肝纤维化模型,利用血液生化分析仪器检测各组小鼠血液中AST、ALT含量,评价ATF4敲除后肝细胞损伤程度的差异。9.应用Western Blot方法检测肝癌患者的癌与癌旁组织样本中ATF4及其他内质网应激相关分子的表达量差异。10.应用Western Blot方法检测小鼠DEN+CCL4诱导的样本中ATF4及其他内质网应激相关分子的表达量差异。11.对含354例肝癌病人的组织芯片进行ATF4的免疫组织化学染色,结合病人随访信息分析ATF4与病人预后的相关性;利用单因素分析、多因素分析ATF4对肝癌病人预后的指导价值。研究结果:1.ATF4全身敲除纯合子及杂合子小鼠的ATF4表达在m RNA和蛋白水平均显著低于野生型C57BL/6小鼠,说明了ATF4敲除可能抑制了肝纤维化的发生。2.在CCL4诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除纯合子及杂合子小鼠的肝纤维化程度均低于野生型C57BL/6小鼠,且纯合子小鼠纤维化程度最低。3.在CCL4诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除纯合子及杂合子小鼠的ATF4水平均低于野生型C57BL/6小鼠,且纯合子小鼠含量最低。4.在CCL4诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除纯合子及杂合子小鼠的肝细胞增殖程度水平均低于野生型C57BL/6小鼠,且纯合子小鼠增殖水平最低。5.在CCL4诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除杂合子小鼠的肝细胞凋亡程度低于野生型C57BL/6小鼠。6.在CCL4诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除纯合子及杂合子小鼠的血液中AST、ALT含量均低于野生型C57BL/6小鼠,肝细胞损伤程度低。7.在BDL诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除杂合子小鼠的ATF4及其他内质网应激相关分子表达水平均低于对照组。8.在BDL诱导肝纤维化模型中,ATF4全身敲除杂合子小鼠血液中AST、ALT含量均低于野生型C57BL/6小鼠,肝细胞损伤程度低。9.人肝癌样本中,癌组织中的ATF4分子表达量明显高于癌旁,且呈现细胞核定位。10.小鼠肝癌样本中,癌组织中的ATF4分子表达量明显高于癌旁,且呈现细胞核定位。11.进一步结合患者临床预后资料进行统计分析发现,ATF4高表达组患者复发时间显著早于低表达组,且总体生存期明显短于低表达组。结论和讨论:本课题第一部分研究主要利用腹腔注射CCL4及BDL两个肝纤维化模型证明了ATF4敲除小鼠的肝纤维化程度明显低于野生型小鼠,BDL之后的死亡率也明显低于对照组小鼠,说明ATF4敲除有减弱肝纤维化的作用;证实了ATF4分子在肝癌标本中表达水平高于癌旁。进一步探究其机制发现ATF4敲除组小鼠在增殖与凋亡两个方面均弱于对照组。通过WB及RT-PCR等方法发现了ATF4表达降低会导致CHOP表达量减少,细胞增殖和凋亡检测证实ATF4的缺失减弱CHOP介导的凋亡变化,提示ATF4缺失可能减轻由CHOP介导的肝细胞凋亡,减轻肝脏炎症微环境,使肝纤维化程度减轻。第二部分研究通过分析化学性(DEN)诱癌小鼠模型标本和肝癌患者组织标本,发现ATF4可能在肝癌发生发展过程中起到重要作用,ATF4高表达及其在细胞核内定位提示肝癌患者预后不良。上述结果提示ATF4及其相关信号通路的关键调控分子可能成为肝纤维化或肝癌的潜在干预靶标。