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选题依据:防己黄芪汤始载于《金匮要略》,具有利水消肿、益卫固表等功效。近年来关于防己黄芪汤在临床上的应用主要集中于心源性水肿和肾病综合征等疾病,确切的利水消肿药理作用使得防己黄芪汤近年来越来越受到关注。到目前为止,课题组前期通过谱效相关辨识黄芪在防己黄芪汤干预阿霉素肾病大鼠的药效成分群。同时,课题组前期建立了防己黄芪汤体内外化学成分的分析方法,初步研究了生理状态防己黄芪汤的体内代谢,但鉴定的成分较少,分析不全面,且未对病理状态下防己黄芪汤成分的吸收进行研究。因此,进一步基于体内过程辨识防己黄芪汤干预阿霉素肾病的药效成分,并确定药效成分的含量,是至关重要的。本研究首先基于UHPLC-Q-Exactive MS对防己黄芪汤入血、尿和粪便中的成分进行分析,明确防己黄芪汤在体内的代谢过程;其次进行动物实验的研究,构建阿霉素肾病大鼠模型,采用代谢组学结合多元统计分析比较两种机体状态下药物的吸收差异成分,明确防己黄芪汤干预阿霉素肾病的药效物质基础;最后,建立基于UPLC-Qtrap-MS技术同时测定防己黄芪汤中19种成分的方法。以期通过体内过程研究,明确防己黄芪汤治疗肾病综合征的物质基础,为防己黄芪汤进一步开发成组分明确、质量可控的中药复方制剂奠定基础,并且为黄芪资源分类评价提供依据。研究目的:本研究采用体内过程分析方法,辨识防己黄芪汤干预阿霉素肾病大鼠的药效成分群,为中药的物质基础研究提供思路,同时为黄芪的分类应用提供研究基础。研究方法:(1)通过UPLC-Q-Exactive MS分析对正常大鼠灌胃防己黄芪汤的血清样本进行体内成分代谢分析。通过多次给予SD大鼠高剂量防己黄芪汤后,甲醇蛋白沉淀法进行血清样品前处理,利用固相萃取处理尿样和粪便,结合体外二级离子碎片和Compound Discover 2.0软件预测,研究防己黄芪汤在生理状态下的原型化合物及其代谢产物;(2)采用代谢组学结合多元统计分析技术,对正常组(C)、模型组(M)、正常大鼠复方干预组(C-FHT)、模型大鼠复方干预组(M-FHT)的血清进行分析,确定复方发挥疗效的药效标志物;同时应用多元统计分析方法分析生理和病理状态下复方的体内代谢谱,分析其在两种机体状态下的吸收差异成分;最后通过相关性分析潜在药效成分与药效标志物之间的相关性,锁定复方的有效成分及其相关的代谢物;(3)利用UPLC-Qtrap-MS联用技术,通过优化色谱和质谱参数,建立了一种同时测定防己黄芪汤中19种成分的方法。研究结果:(1)通过UPLC-Q-Exactive MS分析,共鉴定了100个化合物,其中包括22种原型成分及78种代谢产物。结果表明:灌胃防己黄芪汤水提液后,大鼠血液、尿液和粪便中的主要化学成分为黄酮类化合物及其代谢产物。其中代谢产物主要是以毛蕊异黄酮与甘草异黄酮葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代谢产物为主。上述结果提示这些入血成分可能是防己黄芪汤治疗阿霉素肾病的潜在的药效成分。(2)采用代谢组学技术对4组血清样本包括C、M、C-FHT、M-FHT,进行分析,结合多元统计分析筛选差异代谢物。通过内源性差异代谢物含量变化分析可以看出,生理状态下,防己黄芪汤可显著降低10-HDA含量,显著提高LPE含量(18:2),但对生理状态下的其他代谢物影响不显著。而在病理状态下,防己黄芪汤可显著逆转10-DHA,aspartyl-L-proline,2-methylbutyrylcarnitine,safingol,uric acid和Bis(4-ethylbenzylidene)sorbitol等6个代谢差异物的紊乱。进一步的代谢通路分析显示,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、亚油酸代谢、苯丙氨酸代谢、鞘脂代谢等为关键通路。生理状态下与病理状态下吸收有差异的原型成分包括FanGhinoline、(+)-Tetrandrine、AtractylenolideIII、Liquiritin和Liquiritin。差异代谢产物包括M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7等。通过相关分析可以得出,14个组分如FanGhinoline、(+)-Tetrandrine、AtractylenolideIII、AtractylenolideI、Liquiritin、isoLiquiritin和M1等与药效标志物高度正相关和负相关。然而,其在体内调节的具体关系还需进一步研究。(3)成功构建了基于UPLC-Qtrap-MS技术同时测定防己黄芪汤中19种指标成分的方法。这些成分包括芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。采用多重反应监测模式(MRM)在正、负离子模式下进行检测。方法学结果表明:线性关系良好(R~2≥0.9990),加样回收率在96.10%-101.70%之间。该方法准确快速,测得的样品含量稳定,可用于防己黄芪汤的质量控制研究。以不同产地的黄芪配伍防己黄芪汤,初步确定19种成分的比例为甘草苷(34.15%),粉防己碱(15.97%),防己诺林碱(16.23%),毛蕊异黄酮苷(10.19%),芒柄花苷(7.16%)等。该方法定量表征了样品的化学成分,为黄芪资源评价提供了依据,也为后续的药动学研究提供了方法参考。研究结论:本研究首先基于UHPLC-Q-Exactive MS对防己黄芪汤入血、尿和粪便中的成分进行分析,明确防己黄芪汤在体内的代谢过程;其次进行动物实验的研究,构建阿霉素肾病大鼠模型,并采用代谢组学结合多元统计比较分析两种机体状态下的药物的吸收差异成分,明确防己黄芪汤干预阿霉素肾病的药效物质基础;最后,成功建立基于UPLC-Qtrap-MS技术同时测定防己黄芪汤中19种成分的方法。