竹叶挥发油化学成分及其生物活性研究

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植物资源的综合利用一直是人们研究开发的重点,对植物中化学成分及功能物质的合理开发利用具有重要的现实意义。许多植物挥发油由于其特殊的化学组成,表现出了很好的生物活性,成为开发高效低毒天然香料、抗氧化剂和杀菌剂的重要来源。我国竹子种类多,面积广,经济价值高。竹叶挥发油具有典型的绿叶特征,接近瓜、果、茶的香气,是一种良好的天然香料。竹叶挥发油中含有多种生理活性成分,有可能通过一系列技术加工制备成香料、化妆品、天然抗氧化剂、天然杀菌剂等高附加值产品。为了全面描述竹叶挥发油化学组分的种类、含量,总结禾本科竹亚科竹叶挥发油成分组成规律;揭示竹叶挥发油的抗氧化活性和抗菌活性,同时探讨竹叶挥发油成分与其生物活性间关系,为将来竹叶挥发油在日化领域中的应用提供参考依据。本研究选取橄榄竹、粉单竹、孝顺竹、银丝竹、青皮竹、佛肚竹、黄金间碧竹、短穗竹、香糯竹、方竹、香竹、绿竹、版纳甜龙竹、麻竹、花吊丝竹、云南龙竹、阔叶箬竹、箬竹、尖头青竹、罗汉竹、金镶玉竹、白哺鸡竹、淡竹、水竹、美竹、篌竹、毛竹、乌哺鸡竹、宜兴苦竹和福建茶竿竹等30种竹叶为研究对象,采用水蒸气蒸馏法提取竹叶挥发油,考察了提取时间对挥发油得率的影响;采用GC-MS方法对获得的竹叶挥发油化学成分进行了定性、定量分析;利用红外光谱技术,描述了竹叶挥发油的红外特征;采用清除DPPH自由基法和滤纸片法对竹叶挥发油的抗氧化、抗菌活性进行了测定,并探讨了竹叶挥发油生物活性与其化学成分间的关系。通过研究,得出以下结论:1.为保证竹叶挥发油成分的保真性,尽可能地排除其它因素干扰,本研究采用挥发油提取器提取竹叶挥发油并增加了对水溶性挥发组分的提取。研究表明,竹叶挥发油水蒸气蒸馏方法的工艺条件为:蒸馏时间6h、料液比1:8,以正己烷捕集馏出物,用无水乙醚萃取水溶性挥发性组分。水蒸气蒸馏方法设备简单、生产成本低,适宜竹叶挥发油的提取。竹叶挥发油得率范围为0.252%0.921%(以干重计)。竹叶挥发油提取得率在0.2%0.4%之间的竹种有12种,它们是毛竹、尖头青竹、淡竹、水竹、银丝竹、佛肚竹、金镶玉竹、篌竹、宜兴苦竹、香竹、乌哺鸡竹和福建茶竿竹;竹叶挥发油提取得率在0.4%0.6%之间的竹种有短穗竹、青皮竹、白哺鸡竹、美竹、香糯竹、箬竹、孝顺竹、粉单竹、花吊丝竹、版纳甜龙竹和方竹,共计11种;竹叶挥发油提取得率在0.6%0.8%之间的竹种有5种,分别是云南龙竹、麻竹、罗汉竹、绿竹和橄榄竹;竹叶挥发油得率高于0.8%的竹种有阔叶箬竹和黄金间碧竹。2.采用GC-MS联用技术分析30种竹叶挥发油化学成分的结果表明,竹叶挥发油主要以含氧化合物为主,醇、烃、酚、酮、醛及酸类化合物是竹叶挥发油的主要组成组分,其中醇类物质占有相当大的比重,相对含量达24.703%78.524%。经GC-MS分析,不同竹叶挥发油主含化学成分大体一致,竹种间挥发油的差异主要表现在一些化合物种类上的不同,以及相同化合物含量上的不同。综合分析,竹叶挥发油含有的主要成分有叶醇、植物醇、橙花叔醇、2-辛醇、异植物醇、4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚、植酮、β-紫罗兰酮、α-紫罗酮、法尼基丙酮、烟叶酮、反式-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮、2-己烯醛、壬醛、苯乙醛、二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸丁辛酯、甲酸二十一酯、2-二甲氨基-4-甲基-4-戊烯腈、十六烷酸、十八烷酸、2,3-二氢-苯并呋喃、十七烷基环氧乙烷、三十六烷和二十四烷等化合物。通过对参试竹种竹叶挥发油化学成分总结,竹叶挥发油含有17种共有成分,它们是叶醇、2-己烯醛、对二甲苯、苯乙醛、反式-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮、α-紫罗酮、反式-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮、4-(2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基)-3-丁烯-2-酮、二氢猕猴桃内酯、十五烷、十六烷、十八烷、邻苯二甲酸二异丁酯、植酮、法尼基丙酮、1-(1,2-丙二烯)-环己醇、顺-9-二十三烯等化合物。对竹叶挥发油的17种共有成分进行主成分分析,结果表明竹叶挥发油共有特征成分以醇、酮和醛化合物为主,得出叶醇、植酮、苯乙醛、法尼基丙酮、反式-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮、2-己烯醛和α-紫罗酮等7种化合物为竹叶挥发油主要共有特征成分。竹叶挥发油中叶醇含量范围为7.326% 69.364%,叶醇含量最高的淡竹叶挥发油约为含量最低的短穗竹叶挥发油的9.5倍;2-己烯醛占竹叶挥发油的0.671%3.967%,在毛竹叶挥发油中含量最高;竹叶挥发油中植酮含量为0.983%9.567%;苯乙醛在竹叶挥发油中含量为0.525%4.131% ;法尼基丙酮含量为0.110%2.943% ;α-紫罗酮含量为0.281%2.008%;反式-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮含量为0.152%2.575%。叶醇、苯乙醛、2-己烯醛、α-紫罗酮、植酮和法尼基丙酮特征成分均有青叶香气和果香味,是竹叶挥发油致香化合物,对揭示竹叶挥发油的香气组成特征有重要参考价值。3.利用FT-IR法对30种竹叶挥发油进行了成分分析和比较。竹叶挥发油所含化学成分相对集中,红外光谱也显示出很高的特征性。由于处理方法通用,测试样品中的化学成分相对稳定,因此,其光谱具有很高的重复性和可比性。光谱差异是竹叶挥发油所含化学成分差异的客观反映。结合竹叶挥发油所含烃、醇、酚、酮、醛类化合物的红外特征,可将所得竹叶挥发油红外光谱图划分为五个区段:区段一(34003200cm-1)、区段二(30002800cm-1)、区段三(22001900cm-1)、区段四(18001350cm-1)、区段五(1300800cm-1);区段内峰3360cm-12950 cm-12918cm-12850 cm-11700 cm-11060cm-1可从宏观上分别表征竹叶挥发油所含的醇类、酚类、烃类和羰基类化学成分,21001850cm-1及1160800cm-1区段的非共有峰可表征各竹种之间化学成分的差异。红外图谱作为竹叶挥发油这类含有混合物质群的验证识别手段较为客观、可靠,为竹叶挥发油成分分析提供了有利补充。4.本实验研究表明,采用分光光度法测定竹叶挥发油清除DPPH自由基能力的测定波长为517 nm,反应体系为51.54 mg·mL-1的DPPH 2.0 mL溶液中加0.5mL不同浓度样品溶液,反应时间40min,以IC50值和AE值作为评价竹叶挥发油清除DPPH自由基能力的指标。采用DPPH·法评价竹叶挥发油的抗氧化活性,可以较客观的表达竹叶挥发油的生物活性,是一种简单可行的竹叶挥发油抗氧化活性评价分析方法。以50%抑制浓度(IC50)比较,竹叶挥发油的IC50值越小其清除DPPH自由基能力就越强。竹叶挥发油的IC50值在24 mg?mL-1之间的竹种有黄金间碧竹、毛竹、麻竹、孝顺竹、银丝竹、金镶玉竹;竹叶挥发油的IC50值在46 mg?mL-1之间的竹种有尖头青竹、罗汉竹、绿竹、福建茶竿竹、水竹、橄榄竹、云南龙竹、乌哺鸡竹;竹叶挥发油的IC50值在68 mg?mL-1之间的竹种有版纳甜龙竹、青皮竹、白哺鸡竹、佛肚竹、美竹、篌竹、阔叶箬竹、宜兴苦竹、花吊丝竹、淡竹;竹叶挥发油的IC50值在810 mg?mL-1之间的竹种香竹和香糯竹;竹叶挥发油的IC50值大于10 mg?mL-1的竹种有粉单竹、方竹、短穗竹和箬竹。自由基清除能力AE值越大其清除自由基能力也越强,黄金间碧竹叶挥发油的AE值为0.370 mL·mg-1是箬竹叶挥发油的6.379倍;毛竹、麻竹、孝顺竹、银丝竹和金镶玉竹叶的AE值分别达到了0.349 mL·mg-1、0.303 mL·mg-1、0.291 mL·mg-1、0.277 mL·mg-1和0.255 mL·mg-1,它们均表现出很强的抗氧化活性。黄金间碧竹和毛竹叶挥发油的抗氧化活性接近合成抗氧化剂TBHQ,1g黄金间碧竹和毛竹叶挥发油分别相当于0.309g、0.291g合成抗氧化剂TBHQ所具有的抗氧化能力。1g合成抗氧化剂TBHQ所具有的抗氧化能力分别相当于3.954g麻竹和4.117孝顺竹等竹叶挥发油的抗氧化能力。箬竹叶挥发油的抗氧化能力最低,20.655g箬竹叶挥发油才能达到1gTBHQ的抗氧化能力。竹叶挥发油是由醇类、酚类、酮类等具有各种官能团化合物组成的混合物,竹叶挥发油中化合物的酚基及环结构是其抗氧化作用的重要结构基础。通过30种竹叶挥发油对DPPH自由基捕集活性的比较,富含4-乙烯基-2-甲氧基-苯酚、植酮、异植物醇等成分的竹叶挥发油具有很强的清除DPPH自由基的能力并有剂量效应关系。黄金间碧竹、毛竹、麻竹等竹叶挥发油具有相当理想的抗氧化作用,是有效的外源性抗氧化剂,可通过直接或间接的途径,清除氧自由基,阻断体内脂质过氧化的进程,从而保护细胞免受过氧化损伤,维持细胞正常的生理功能。黄金间碧竹、毛竹、麻竹和孝顺竹叶挥发油具有开发天然源抗氧化剂的潜力。5.将提取的30种竹叶挥发油稀释成5个梯度浓度对6种测试菌种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、黄曲霉和黑曲霉进行抗菌效果测定。处理24小时后,高浓度(25 mg·mL-1)的宜兴苦竹和阔叶箬竹叶挥发油对枯草芽孢杆菌具有高度抑制作用,云南龙竹和花吊丝竹叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有较高抑制作用。高浓度(25 mg·mL-1)的云南龙竹、花吊丝竹、宜兴苦竹和阔叶箬竹叶挥发油对白色假丝酵母菌、黄曲霉和黑曲霉具有中度抑制作用。综合分析,不同竹叶挥发油对相同菌种抑制效果不同,同一竹叶挥发油对不同菌种抑制作用也不同。云南龙竹、花吊丝竹和阔叶箬竹叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵母菌、黄曲霉和黑曲霉均有体外抑制作用,宜兴苦竹叶挥发油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和白色假丝酵母菌有抗菌作用,并且在一定剂量范围内随剂量增加而增强。4种竹叶挥发油对不同菌种的抑制作用存在差异,并具有一定的互补性。竹叶挥发油的抗细菌效果优于抗真菌。竹叶挥发油中含有许多不饱和的醇、醛、酮、酸和萜烯类化合物,在这些含量较高的物质结构中均含有不饱和双键,表现出一系列的生理活性。其中云南龙竹、花吊丝竹、宜兴苦竹和阔叶箬竹叶挥发油等富含叶醇、2-辛醇、植酮、紫罗兰酮、2-己烯醛、苯乙醛、壬醛化合物,对测试菌种有不同程度的抑制作用。竹叶挥发油中的叶醇、2-辛醇、植酮、紫罗兰酮、2-己烯醛、苯乙醛、壬醛是其抗菌作用的重要物质基础。竹叶挥发油中化合物的羟基及不饱和双键是其抗菌作用的重要结构基础。竹叶挥发油是粗提取物,是很多成分的混合体系,抗菌作用效果可能是多种成分协同、多靶点作用的结果。云南龙竹、花吊丝竹、阔叶箬竹和宜兴苦竹叶挥发油具有开发天然源杀菌剂的潜力。
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