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背景胃癌(Gastric cancer,GC)是全球最常见的肿瘤之一。中国是胃癌高发病率、高死亡率的地区。早期发现,及时治疗可以显著改善包括胃癌在内多种肿瘤患者的生存状况,但是因症状隐匿、筛查力度难度的问题,以及胃癌进展较快、侵袭能力强等,使得胃癌转移发生率居高不下,且预后较差。大部分胃癌被诊断时已属晚期,腹膜转移是晚期胃癌常见的转移类型。胃癌腹膜转移的情况一直是胃癌治疗效果的瓶颈,我们尚缺乏这方面的研究。因此,迫切需要研究胃癌腹膜转移的潜在机制及特点,为胃癌的诊断治疗及预后提出新的靶点和有依据的干预措施。目的克服氧化应激与抵抗失巢凋亡对肿瘤的生长和转移至关重要,为明确胃癌抵抗失巢凋亡和抗氧化代谢方面的认识和寻找相关的治疗靶点,本课题的主要目的在于:1、探究烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT,Nicotinamide nucleotide transhydrogenase)对于胃癌NADPH稳态调节和失巢凋亡抵抗的影响。2、揭示脂肪细胞/胃癌细胞微环境下,癌胞代谢重塑通过甘油二酯酰基转移酶2(DGAT2,Diacylglycerol acyltransferase 2)蓄积脂滴抵抗失巢凋亡实现腹膜转移的功能。方法第一部分1、RT-qPCR和WB检测胃癌细胞以及胃癌组织标本中NNT的mRNA和蛋白表达水平。IHC检测胃癌标本中NNT的表达情况,结合临床资料绘制预后生存曲线。2、慢病毒构建NNT敲降胃癌稳定细胞株(HGC27、BGC823)。悬浮培养后,检测NNT敲降组和对照组胃癌细胞NADPH/NADP~+和GSH/GSSG含量。流式细胞术检测线粒体及总ROS水平和Annexin V/PI染色后的细胞凋亡情况。软琼脂克隆形成实验检测胃癌细胞的非锚定生长能力。3、将构建好的NNT敲降胃癌稳定细胞株及对照细胞株通过皮下接种、腹腔注射和尾静脉注射方式注射入裸鼠体内,观察裸鼠皮下瘤的生长及腹腔肠系膜肿瘤结节和肺转移结节的转移情况。取标本包埋进行染色,观察病理情况。第二部分1、高脂饮食(HFD)诱导小鼠(裸鼠、SCID小鼠)肥胖模型,监测体重及血脂。腹腔注射转移模型观察肥胖或HFD对胃癌腹膜转移的影响。并比较普通饮食组和HFD组小鼠腹腔肿瘤结节中脂肪酸代谢通路关键酶的mRNA表达变化。2、提取人腹腔网膜脂肪细胞,与胃癌细胞共培养后。分别检测胃癌细胞DGAT2的mRNA和蛋白表达水平;BODIPY 493/503荧光染色观察细胞中脂滴含量和分布。3、慢病毒构建DGAT2敲降胃癌稳定细胞株。与脂肪细胞共培养后,荧光染色观察对照组与DGAT2敲降组细胞中脂滴含量;检测细胞中甘油三酯、NADPH/NADP~+和GSH/GSSG的含量。4、悬浮培养条件下,与脂肪细胞共培养后,检测胃癌细胞中线粒体和总ROS水平。Calcein AM/EthD-1染色检测胃癌细胞的失巢凋亡情况。5、将构建好的DGAT2敲降胃癌稳定细胞株及对照细胞株注射入裸鼠和SCID小鼠体内,观察HFD条件下小鼠的腹膜转移和肺转移情况。6、DGAT2抑制剂预处理胃癌细胞后,观察对照组与抑制剂组细胞水平的脂滴含量。悬浮培养条件下,检测胃癌细胞与脂肪细胞共培养后的失巢凋亡;同时用抑制剂腹腔注射后,观察小鼠腹腔成瘤情况。7、IHC检测DGAT2在人胃癌、癌旁组织和淋巴结转移组织的蛋白表达水平。WB检测配对胃癌组织标本中DGAT2的蛋白表达水平。结合临床资料绘制预后生存曲线,应用Cox回归模型分析预后因素。结果第一部分1、胃癌细胞或胃癌组织中NNT的mRNA和蛋白表达均升高。人胃癌和淋巴结转移组织中NNT高表达。生存分析结果显示,NNT高表达与总体生存期(p=0.003)和无疾病生存期(p=0.006)负相关。2、成功构建NNT敲降的胃癌稳定细胞株(HGC27、BGC823)。悬浮培养后,NNT敲降组GC细胞的NADPH/NADP~+和GSH/GSSG的含量均显著降低(p<0.01),且线粒体及细胞总的ROS水平升高,GC细胞的凋亡增加,非锚定生长能力降低。3、动物实验结果表明,胃癌细胞NNT敲降组裸鼠皮下成瘤能力减弱,其标本染色表明细胞增殖减少,凋亡增加。敲降组裸鼠的肺转移和腹膜播散能力受到抑制,小鼠生存时间更长(p<0.01)。第二部分1、成功建立HFD诱导小鼠肥胖模型以及腹腔成瘤模型。HFD组小鼠较普通饮食组拥有更多腹腔播散肿瘤,且小鼠(裸鼠)生存时间显著缩短(p=0.017)。其腹腔转移肿瘤结节中CD36、GPD1/2、GPAT1、AGPAT1、PAP、DGAT1/2、CPT1A、NADK2和NNT的表达较对照组均显著升高(p<0.01)。而DGAT2的表达升高最为明显。2、成功提取脂肪细胞。与胃癌细胞共培养后,胃癌细胞中DGAT2的mRNA和蛋白表达均升高,并且脂滴的含量增加。3、成功构建DGAT2敲降胃癌稳定细胞株。共培养后,敲降组脂滴形成量较对照组更少;同时细胞中TG、NADPH/NADP~+以及GSH/GSSG的含量降低(p<0.01)。4、悬浮培养条件下,与脂肪细胞共培养后,胃癌细胞中线粒体和总ROS水平降低,失巢凋亡减少。然而,这些现象可以被DGAT2敲降所逆转。5、动物实验结果表明,DGAT2敲降能显著抑制HFD诱导裸鼠和SCID小鼠的腹腔成瘤能力(p<0.01)以及裸鼠的肺转移(p<0.01)。6、DGAT2抑制剂预处理后,抑制了油酸诱导胃癌细胞中脂滴的形成。在悬浮培养条件下,与脂肪细胞共培养后,抑制剂组胃癌细胞的失巢凋亡增加。抑制剂腹腔注射后,小鼠腹腔成瘤能力较对照组减弱。7、IHC结果表明DGAT2在淋巴结转移组织和胃癌网膜转移组织中高表达。配对的转移组织中DGAT2蛋白水平较原发肿瘤组织更高。生存分析结果表明,DGAT2高表达病人的OS和DFS比低表达的病人更短(p<0.001)。此外,生存资料Cox回归分析的结果表明,DGAT2高表达(RR=1.50,95%CI:1.01~2.21,p=0.043),淋巴结侵袭(RR=2.08,p=0.021)及胃癌晚期(RR=2.47,p=0.000)是独立的不良预后因素。结论第一部分:1、NNT的高表达与胃癌转移及预后不良正相关。2、在非锚定生长的应激条件下,NNT基因敲降导致胃癌细胞中NADPH显著降低,ROS水平升高,加速胃癌细胞失巢凋亡。3、敲低NNT能够抑制裸鼠体内胃癌细胞移植瘤的生长、肺转移和腹膜播散。第二部分:1、HFD促进小鼠胃癌腹膜转移和DGAT2表达上调。2、DGAT2促进脂肪细胞或油酸诱导的脂滴形成和NADPH产生。3、DGAT2调节氧化还原稳态增强胃癌细胞抵抗失巢凋亡。4、敲低DGAT2可以抑制HFD诱导的小鼠胃癌腹膜播散和肺转移。5、DGAT2高表达的胃癌患者预后不良。