脂肪酶是一种多用途水解酶,在疏水环境中表现出优异的活性,主要从动、植物及微生物中筛选得到,可广泛应用于食品加工、精细化工、化妆品、医药工业化妆品、生物柴油生产和洗涤剂工业中。实验室前期已成功地将黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶（Aspergillus niger GZUF36 extrellular lipase,EXANL1）在毕赤酵母中进行重组表达。本论文首先对毕赤酵母重组黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶（Recombinant Aspergillus niger GZUF36 extracellular lipase expressed by Pichia pastoris,PEXANL）进行培养条件优化,以提高其酶活力,利于后续的固定化及PEXANL1纯化结晶。然后对不同固定化条件对PEXANL1的酶活力以及二级结构的影响以及固定化前后的PEXANL1酶学性质进行探究,初步进行了PEXANL1的晶体初筛,为深入分析PEXANL1的构效关系奠定基础。具体研究内容及结果如下所示:（1）探究了不同培养条件对PEXANL1的酶活力的影响,得到的最优培养条件为:当接种量为3.2%,BMMY的培养基pH为6,培养时间为4 d,甲醇添加量为1%时,此时的酶活达到33.80±0.57 U/mL,经响应面试验设计优化后得到的最优条件为:接种量为3.2%,BMMY的培养基pH为7,培养时间为5 d,甲醇添加量为1%,经验证试验,得到的PEXANL1的酶活最高为92.51±0.03 U/m L,约为初始酶活的6倍。（2）以壳聚糖-Fe3O4磁性纳米颗粒（Chitosan-Fe3O4 magnetic nanoparticles,Fe3O4@CS MNPs）为载体,采用了吸附-沉淀-交联固定化法高效固定化PEXANL1得到了固定化酶PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs。通过扫描电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、热重分析、振动样品磁强计表征了Fe3O4@CS MNPs的合成情况以及Fe3O4@CS MNPs与PEXANL1的结合情况,结果表明Fe3O4@CS MNPs合成情况良好,与PEXANL1成功地结合。探究了不同固定化条件对PEXANL1的酶活力以及二级结构的影响,在乙腈与丙酮等体积混合作为沉淀剂,载体质量125 mg,沉淀剂与酶液比例为4:1,戊二醛浓度为15 mM,交联时间为1 h的条件下,得到了酶活力最高的PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs,此时酶活回收率达到153.73±2.00%,固定化效率为71.55±0.77%。与游离酶相比,经吸附-沉淀-交联最优条件固定化后得到的固定化酶PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的二级结构为:α-螺旋相对含量为31.29%,β-折叠相对含量为18.54%,β-转角相对含量为20.33%,无规则卷曲相对含量为29.85%,与游离酶相比,无规则卷曲含量增加了29.85%,α-螺旋、β-折叠、β-转角的相对含量分别减少了5.95%、1.66%、20.44%。（3）探究了固定化前后PEXANL1的酶学性质,结果表明游离酶的最适pH为4,而固定化酶的最适pH是3,往酸性条件偏移。PEXANL1的pH稳定性通过固定化策略有所提高,PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs在pH 2–10的环境下相对酶活均可达到65%以上。固定化PEXANL1的最适温度为45℃,较游离酶增加了5℃。固定化策略改变了PEXANL1的温度稳定性,PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的温度稳定性比PEXANL1高。PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs对Zn2+,Fe2+,Fe3+,Na+,K+,Cu2+,Mn2+,Ca2+,Mg2+这九种金属离子的耐受性高于游离酶,固定化PEXANL1的有机溶剂耐受性有较大的提高,并且经过四氢呋喃、乙腈、叔丁醇、乙醚处理后的固定化酶都出现了超酶活现象。在储藏稳定性方面固定化后的PEXANL1较游离酶有明显提高。通过对PEXANL1与PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的动力学参数进行测定,发现固定化提高了PEXANL1的最大反应速率（Vmax）,PEXANL1的最大反应速率为10.64 mmol/L/min,PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的最大反应速率（Vmax）为18.45 mmol/L/min。而PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的Km值比游离酶低,说明PEXANL1经固定化后对底物的亲和力增强。对固定化酶PEXANL1-Fe3O4@CS MNPs的可重复利用性测试,经过8次循环利用后,保持了大约50%的相对活力。（4）进行结晶条件初筛,使用8 mg/mL蛋白浓度的PEXANL1对98个结晶条件进行了筛选,经过21天的培养,出现了疑似为PEXANL1的晶体。