基于信号放大的高灵敏比色分析法及其在检测中的应用

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通过将高特异性抗原抗体或核酸适配体与比色法相结合而构建的比色分析模式,具有特异性高、可视化、响应速度快、操作简单等优点,已成为检测生物分子的主要分析方法之一。为提高检测灵敏度,信号放大技术在比色传感器的构建至关重要。本文旨在结合比色传感技术和酪胺信号放大、酶辅助信号放大及无酶信号放大等策略,构建几种新型比色传感分析模式实现对肿瘤标志物的检测,提高分析的灵敏度,降低检测限。本文主要研究内容如下:第一章:首先对比色分析的原理、分类以及常用于比色分析法的检测应用进行简单概述,然后重点介绍几种信号放大技术。最后,简要介绍本论文的主要研究目的及内容。第二章:构建了一种基于酪胺信号放大(Tyramine signal amplification,TSA)策略的比色分析方法。以多巴胺-锰/硫化锌量子点(Dopamine-manganese/zinc sulfide quantum dots,DA-QDs)为反应媒介,紫外可见分光光度计(Ultraviolet and Visible spectrophotometer,UV-Vis)为检测手段,采用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au NPs),其表面用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)和羊抗小鼠免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)修饰制备二抗(IgG-Au NPs-HRP)作为信号放大标签。当目标物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)存在时,兔抗AFP抗体(Rabbit anti-AFP antibody,Ab1)、AFP和IgG-Au NPs-HRP在金电极上形成夹心免疫复合物,而过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)和酪胺-辣根过氧化物酶(Tyramine-horseradish peroxidase,Tyr-HRP)触发二抗上的HRP产生Tyr-HRP重复序列实现酪胺信号放大。在实验条件优化下,吸光度值与AFP浓度在0.1-80 pg/m L范围内具有很好的线性相关,检出限为0.044 pg/m L。检测结果与ELISA试剂盒的测定结果具有很好的一致性,体现出该比色分析模式在AFP样品检测中巨大的应用潜力。第三章:构建一种基于酶辅助循环信号放大策略的比色分析模式。利用二价铁(Fe2+)-铁氰化物(K3Fe(CN)6)体系(黄-绿-蓝)进行视觉显色分析。通过金纳米颗粒(Au NPs)诱导铜沉积,建立一种高灵敏的比色检测方法识别Fe2+和Fe3+,且基于适配体和CEA的特异性识别,可同时检测CEA。辅助DNA(Auxiliary DNA,a DNA)修饰的Au NPs诱导铜沉积发生,形成a DNA/Au NPs/Cu复合物。基于碱基互补配对原则,底物DNA(Substance DNAs,DNA)与a DNA结合形成s DNA/a DNA/Au NPs/Cu复合物。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)加入,其与s DNA结合力更大,因而a DNA/Au NPs/Cu脱落与互补DNA(Complementary DNA,c DNA)结合;核酸外切酶I(Exonuclease I,Exo I)可剪切与CEA结合的s DNA,释放的CEA继续竞争结合s DNA/a DNA/Au NPs/Cu中的s DNA,如此循环,实现信号放大。实验结果表明,吸光值与CEA浓度在0.0001-100 ng/m L范围内呈现良好的线性关系,检测限为0.032 pg/m L。与此同时,将所构建传感分析模式与ELISA试剂盒进行比较,结果表明该模式可用于血清样本中CEA的定量。第四章:构建一种以银纳米颗粒(Silver nanoparticles,Ag NPs)为信号产生和扩增标记的无酶比色法。利用银离子与1,10-邻菲啰啉(1,10-Phenanthroline,Phen)和溴邻苯三酚红(Bromopyrogallol red,BPR)反应形成蓝色三元配合物的特性;Ag NPs释放出Ag+可与邻菲啰啉(Phen)形成Ag(Phen)+络阳离子,该络阳离子与溴邻苯三酚红阴离子[BPR]4-在中性或弱酸性介质中结合成蓝色的三元络合物;释放出的Ag+越多,结合的三元络合物越多,继而信号越大。以此为显色原理,基于抗原抗体的特异性结合,可实现对目标物的定性及定量检测。研究结果表明,吸光值与前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)浓度在0.00001-1000 ng/m L范围内具有很好的线性相关性,检测限可达2.2 fg/m L。将所构建比色分析模式与ELISA试剂盒进行比较,表明该方法可用于实际样本中PSA的检测。
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