论文部分内容阅读
目的:探究白花蛇舌草干品和鲜品及其水提液和乙醇提取液抗炎效应的差异性;分析干品和鲜品各物质成分对抗炎效应的贡献度,为白花蛇舌草在临床抗炎的合理应用提供基础。方法:采用MTT法评价白花蛇舌草提取物对RAW264.7巨噬细胞的活力的作用,通过ELISA法检测提取物对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影响;应用体内二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠扭体实验模型,以提取物对耳肿胀和扭体次数的抑制率评价白花蛇舌草的体内抗炎镇痛效应。建立白花蛇舌草高效液相色谱（HPLC-DAD）指纹图谱,色谱柱为Extend-C1 8柱（4.6×250 mm,5μm）;流动相:甲醇-0.05%磷酸水（pH 2.3）梯度洗脱;检测波长:254 nm;柱温:30℃;流速:1 mL/min;进样量:10μL。应用建立的指纹图谱比较白花蛇舌草干品和鲜品特征峰及指认化学成分含量的差异,并将其体外抗炎效应作为评价指标,采用灰色关联度和偏最小二乘分析法研究各特征峰对抗炎效应的贡献程度。结果:（1）白花蛇舌草干品水提液在1、5、10、15μg生药/mL浓度范围内剂量依赖的抑制LPS引起的RAW264.7细胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,其中10、15μg生药/mL对3个炎症因子的水平呈显著抑制（P＜0.05）。2、4、8 g生药/kg三个剂量均可剂量依赖地显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀度和减少醋酸致小鼠扭体次数（P＜0.05）。白花蛇舌草干品醇提液在15μg生药/mL浓度下对IL-1β、1μg生药/mL浓度下对IL-6抑制作用明显（P＜0.05）,其它均无明显降低作用。2、4、8 g生药/kg三个剂量均可显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀度和减少醋酸致小鼠扭体次数（P＜0.05）,但无剂量依赖关系;且8 g生药/kg剂量下醇提液对小鼠耳肿胀度的抑制作用显著弱于水提液（P＜0.05）。（2）白花蛇舌草鲜品水提液在4、20、40、60μg生药/mL浓度范围内可抑制LPS引起的RAW264.7细胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,其中40、60μg生药/mL浓度范下对3个炎症因子的水平呈显著抑制作用（P＜0.05）。8、1 6、32生药/kg三个剂量均可剂量依赖性显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀度和减少醋酸致小鼠扭体次数（P＜0.05）。白花蛇舌草鲜品醇提液在20μg生药/mL浓度下对IL-1β、60μg生药/mL浓度下对IL-6、4μg生药/mL浓度下对TNF-α降低作用明显（P＜0.05）,其余均无明显抑制作用。8、16、32生药/kg三个剂量均可显著抑制小鼠耳肿胀度和减少小鼠扭体次数（P＜0.05）,但均无剂量依赖关系;且组间同剂量下,醇提液在3个剂量下对小鼠耳肿胀度的抑制作用、8 g生药/kg剂量下对小鼠扭体次数的降低均显著弱于水提液（P＜0.05）。（3）白花蛇舌草鲜品经过自然干燥成干品,平均失重37.28 g±0.88,因此鲜品的用药浓度相当于干品浓度的4倍。等同剂量白花蛇舌草干品水提液和鲜品水提液比较结果显示:等同剂量下,鲜品水提液浓度为40μg生药/mL对IL-1β,20、40μg生药/mL对IL-6,20μg生药/mL对TNF-α水平的抑制程度大于干品（P＜0.05）,干品水提液浓度为15μg生药/mL对IL-1β和IL-6的抑制程度较鲜品有显著性差异（P＜0.05）;鲜品的低剂量组对小鼠耳肿胀度,低、中剂量组对扭体抑制作用较干品有优势（P＜0.05）,3个剂量组对小鼠血清中TNF-α水平,低剂量对血清中IL-6水平的抑制作用较干品更显著（P＜0.05）。（4）分别建立白花蛇舌草干品和鲜品水提液的指纹图谱,各批次相似均大于0.9。干品水提液指纹图谱标定36个共有峰,鲜品水提液指纹图谱标定48个共有峰;两者共有成分31个;指认共有成分4个,分别为咖啡酸、对香豆酸、芦丁、槲皮素。聚类分析、共有峰差异分析、主成分分析和偏最小二乘分析结果表明,干品和鲜品化学成分有明显差异,分析有25个主要差异成分,其中F37、F2、F38、F25、F14为5个关键差异成分。（5）应用灰色关联度谱效关系的分析结果显示:以3种炎症因子的综合灰关联度为依据,干品和鲜品的水提液共有有效成分10个,分别是F45（槲皮素）、F6、F48、F9、F52、F10、F26（对香豆酸）、F25、F29号峰;干品成分的抗炎作用大小排序:F45（槲皮素）＞F7＞F35＞F9＞F38＞F6＞F53＞F51＞F46＞F52＞F1 0＞F26（对香豆酸）＞F2＞F39＞F25＞F48＞F29（r＞0.6）;鲜品成分的抗炎作用大小排序:F34＞F44＞F1 1＞F6＞F23＞F45（槲皮素）＞F13＞F24＞F33＞F48＞F25＞F49＞F52＞F19（咖啡酸）＞F9＞F12＞F42＞F30＞F26（对香豆酸）＞F15＞F50＞F29＞F10（r＞0.6）。（6）应用偏最小二乘谱效关系的分析结果显示:以IL-1β炎症因子为指标,干品有效成分抗炎作用大小:F5＞F49＞F36＞F53,其中F5号峰为该药效的主要贡献峰;鲜品有效成分抗炎作用大小:F25＞F11＞F34＞F23＞F49＞F48＞F53＞F52＞F24＞F45,其中F25、F11号峰为该药效的主要贡献峰。以IL-6炎症因子为指标,干品有效成分抗炎作用大小:F35＞F39＞F6＞F52＞F16＞F38＞F37＞F48＞F29＞F51＞F47＞F9＞F44,其中F35号峰为该药效的主要贡献峰;鲜品有效成分抗炎作用大小:F19＞F20＞F25＞F34＞F11＞F26＞F49＞F48＞F9＞F10,其中F19号峰为该药效的主要贡献峰。以TNF-α炎症因子为指标,干品有效成分抗炎作用大小:F24＞F45＞F11＞F40＞F51＞F9＞F52＞F48＞F2＞F46＞F38,其中F24、F45号峰为该药效的主要贡献峰;鲜品有效成分抗炎作用大小:F11＞F49＞F50＞F48＞F53＞F42＞F45＞F52＞F34＞F13,其中F11号峰为该药效的主要贡献峰。（7）综合灰色关联度和偏最小二乘回归分析方法,显示:F45（槲皮素）、F6、F9、F48号峰是白花蛇舌草干品和鲜品水提液的共有药效峰;F9、F38、F45（槲皮素）、F48、F51、F52、F53号峰是干品抗炎的过程中的主要药效峰;F25、F26（对香豆酸）、F11、F34、F44、F45（槲皮素）、F48、F49号色谱峰在鲜品抗炎的过程中起关键作用。结论:（1）白花蛇舌草干品和鲜品抗炎效应均以水提液为优,临床应用的合理使用方法宜采用水煎煮内服;且白花蛇舌草鲜品水提液的抗炎效应较干品水提液为佳,谱效关系分析表明白花蛇舌草干品和鲜品的抗炎效应物质基础存在差异。（2）本研究建立的指纹图谱可分别作为白花蛇舌草干品和鲜品质量控制标准。