捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是毛圆科寄生性线虫,寄生于反刍动物第四胃,引起动物贫血、消瘦、腹泻、衰弱、乃至死亡,给畜牧业造成巨大的经济损失。目前虽有一个商品化疫苗Barbervax,但因其生产成本高而未被广泛使用。发掘新的疫苗候选抗原对该病的免疫预防具有重要意义。前期研究发现捻转血矛线虫基质金属蛋白酶12A（matrixmetalloproteinase 12A,MMP12A）重组蛋白已被证实对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定的保护效果。本文在此基础上构建了真核表达质粒pVAX-MMP12A,将真核质粒和重组蛋白进行不同组合免疫山羊,进一步研究其对山羊的免疫保护作用。为探索该基因在虫体生长发育中的功能,利用RNA干扰技术对捻转血矛线虫第三期幼虫MMP12A基因进行沉默,对其感染山羊的能力进行了研究。1 重组质粒pVAX-MMP12A的构建复苏本实验室保存的转化有pET-32a-MMP12A质粒的大肠杆菌BL21菌株,提取重组质粒进行双酶切,获得MMP12A基因,并通过DNA重组技术,将MMP12A基因连接到真核表达载体pVAX上,得到真核重组质粒pVAX-MMP12A。将该真核重组质粒肌肉注射小鼠,Western blot检测结果表明,MMP12A获得了表达。2 MMP12A对山羊的保护性研究将25只健康山羊随机分为5组,每组5只,第0天首免,第14天进行第二次免疫。第1组为空白对照组;第2组为攻虫对照组;第3组首免和第二次免疫均使用重组质粒pVAX-MMP12A;第4组首免为重组pVAX-MMP12A质粒,第二次免疫为重组MMP12A蛋白;第5组首免为重组MMP12A蛋白,第二次免疫为重组质粒pVAX-MMP12A。第二次免疫后14天,对第2-5组山羊人工感染8000条捻转血矛线虫三期幼虫（第1组为不感染对照组,不攻虫）,并在不同的时间点采集血清和粪便样品,对血清细胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-4、、IL-9和IL-17,IgA和IgG,虫卵计数和成虫荷虫量等指标进行分析。ELISA检测结果显示,三个免疫组与两个对照组山羊在整个试验期间相比特异性抗体IgA滴度变化不明显,均在小范围内波动;三个免疫组山羊特异性血清抗体IgG在首次免疫后滴度均明显上升,第二次免疫后继续上升;血清细胞因子检测结果显示,两个对照组的IFN-γ水平在攻虫前这段期间变化不明显,在一个正常的范围内波动,三个免疫组变化较为明显,首免后略有增长,第二次免疫后明显上升;两个对照组IL-9水平在攻虫前在一个较低的波动范围内,变化不明显,三个免疫组较两个对照组首免后显著升高,第二次免疫后变化不大;血清细胞因子IL-4水平两个对照组无明显变化,三个免疫组较两个对照组在首免后上升,第二次免疫后上升明显;血清细胞因子IL-17、TGF-β各组数据变化规律不明显,差异性不显著。虫卵计数和成虫荷虫量结果显示,不免疫不攻虫对照组为0,三个免疫组分别与不免疫攻虫对照组相比,第3组、第4组和第5组虫卵减少率分别为68.14%、67.18%和72.17%,成虫荷虫量减少率分别为70.38%、69.43%和76.79%。以上结果表明捻转血矛线虫基质金属蛋白酶12A有良好的免疫保护作用,具有潜在的应用价值。3 RNAi沉默MMP12A基因对虫体发育的影响合成一对本实验室已证实的对MMP12A基因具有较好干扰效果的siRNA（S2）和一对无关干扰RNA（SN）,用浸泡法将2对siRNA分别转入活化的捻转血矛线虫第三期幼虫,同时用同样条件以PBS代替siRNA设置对照组。每组分别取幼虫（其中一小部分）提取mRNA,反转录cDNA,并进行荧光定量PCR,检测干扰效果。结果显示S2组基因表达下降明显。将20只健康山羊随机分为4组（n=5）,第一组是空白对照组（Nc）;第二组（PBS组）人工感染8000条上述PBS处理的捻转血矛线虫第三期幼虫;第三组（S2组）人工感染8000条经S2处理的捻转血矛线虫第三期幼虫;第四组（SN组）人工感染8000条经SN处理的捻转血矛线虫第三期幼虫。感染后于不同时间点对试验组山羊进行虫卵计数、虫卵孵化率、成虫荷虫量和成虫长度等检测分析。结果显示,SN组与PBS组相比,各组数据差异不显著;S2组与PBS组相比,每克粪便虫卵数（EPG）减少61.61%,成虫荷虫数减少56.42%,雌、雄虫虫体长度分别减短16.7%和11.6%,虫卵孵化率减少20.43%,组间差异显著。以上结果表明MMP12A基因在虫体生长发育中发挥重要作用。