随着我国养殖业规模的不断增加,繁殖障碍性疾病已从危害单一猪群扩大到威胁整个养殖业的健康发展。多种病毒和细菌均可引起猪繁殖障碍性疾病,其中危害较大的为猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、日本乙型脑炎病毒（Japanese encephaliti s virus,JEV）及猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV）。感染上述病原的母猪群常表现屡配不孕、流产、产死胎及弱胎。繁殖障碍性疾病不仅导致猪群的生产性能下降,还可降低猪群的免疫效果,为混合感染的发生埋下了祸患。目前,针对以上四种疾病临床最常见的抗体检测方法为ELISA、血凝和血凝抑制实验、胶体金免疫层析试纸条以及中和试验。但ELISA不能同时且大批量的检测多种病毒抗体;血凝和血凝抑制实验需要对红细胞及待测血清进行预处理,操作繁琐且检测灵敏度较低;胶体金免疫层析试纸条研发成本较高,同时因缺少有效的单抗而适用范围有限;中和试验方法繁杂,检测过程需要鸡胚或细胞,故一般不作常规使用。此外,上述的抗体检测方法不能满足临床快速高通量检测的需要。蛋白芯片技术作为新型的抗体检测技术,因其高通量的特点被广泛应用于疾病诊断。因此,本研究应用原核表达系统表达并纯化了 CSFV结构蛋白E2、PPV核衣壳蛋白VP2、JEV囊膜蛋白E主要结构域Ⅲ和PRRSV核衣壳蛋白N,并经Western blotting鉴定了它们的免疫反应性。将以上蛋白作为诊断抗原点样于环氧基片上,经一系列条件优化后,成功研制了检测CSFV、PPV、JEV和PRRSV四种抗体的多重蛋白芯片,并进行了临床初步应用,为猪重要疫病的临床监测和防控奠定了基础。1.CSFV、PPV、JEV和PRRSV主要蛋白的原核表达与纯化本研究针对CSFV E2第193～531位基因、JEV E第850～1305位基因、PRRSV N基因全长分别设计了特异性扩增引物,通过PCR扩增得到相应的目的片段。将纯化后的目的基因克隆至pET-32a原核表达载体;同时优化密码子后的PPV VP2蛋白第156～438位氨基酸基因片段克隆至pCold Ⅰ原核表达载体,得到四种原核重组表达质粒。将四种重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经0.2 mmo/LIPTG 18℃诱导16 h,成功表达的重组蛋白经HISTRAP HPNi柱纯化后,经过聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定,结果表明本实验顺利表达了 CSFV-E2、PPV-VP2、JEV-EDⅢ和PRRSV-N四种蛋白,为后续蛋白芯片检测方法的建立奠定了基础。2.研制蛋白芯片检测CSFV、PPV、JEV和PRRSV四种病毒抗体将成功表达并纯化的CSFV-E2、PPV-VP2、JEV-EDⅢ和PRRSV-N四种蛋白作为相应疾病的诊断抗原,点样至环氧基片,经过水合、封闭、洗涤等步骤制备多重蛋白芯片。制备好的蛋白芯片可立即使用也可以放置于4℃保存。经过条件优化,确定蛋白点样浓度及一抗、二抗的稀释度及孵育时间,成功建立了Cy3荧光标记蛋白芯片。用建立的蛋白芯片与市面流通的ELISA试剂盒同时检测了 200份临床猪血清样本,结果发现两者阳性和阴性符合率分别为95.8%～100%以及86.2%～100%,且无交叉反应。结果表明研制的检测四种病毒性疫病抗体的多重蛋白芯片能够为临床快速诊断服务,可用于疫病防控。