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背景:作为严重危害人民健康的重大疾病之一,恶性肿瘤在我国诸多疾病中导致了最高的人口死亡率。相较于机体正常细胞,肿瘤细胞所特有的生长代谢模式,为其提供了极大的生存和侵袭优势,使得肿瘤细胞对人类健康危害巨大且令人束手无策。早在1927年,Warburg等就观察到,与正常细胞相比,肿瘤细胞往往能通过糖酵解途径代谢更多的糖并产生大量乳酸。醛缩酶A(EC4.1.2.13,ALDOA)是糖酵解和糖异生途径中的一个重要代谢酶,从而调控机体能量代谢过程。现有研究提示,ALDOA在诸多癌症中过表达,如鳞状细胞肺癌和结肠癌,部分肿瘤病人血清中ALDOA表达明显增高,表明ALDOA可能是肿瘤发展和恶变的关键分子。ALDOA不仅在糖酵解中起着重要作用,还参与到细胞其他功能中,如信号转导,囊泡转运,细胞运动等。但目前ALDOA与肝癌发展的关系尚不清楚,其能否成为肝癌诊断指标、其抑制剂能否成为抑制肿瘤生长与转移的候选化合物,还有待于证实。我们实验室前期研究发现:ALDOA能促进肝癌的转移,同时多糖能影响肝癌细胞ALDOA的表达,目前尚无文献报道相关工作。目的:本课题拟采用药理学和基因干预(病毒感染)相结合的手段,应用分子生物学技术和相关细胞功能学实验,从分子、细胞和整体动物水平明确ALDOA在肝癌发生发展中的调控机制,进一步筛选以ALDOA为治疗靶点的抗肿瘤当归多糖,初步建立以ALDOA为靶点的新药筛选模型。方法:(1)选取临床肝癌样本组织芯片,应用免疫组织化学法(IHC)检测ALDOA在人肝癌组织样本中的蛋白表达,分析其与癌旁组织相比ALDOA表达的变化;并同时检测了肿瘤转移相关标志物上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)在人肝癌组织样本中的表达,并运用Spearman相关性分析法分析其相关性。(2)肝癌细胞株筛选,检测不同肝癌细胞株中ALDOA表达,其中HepG2细胞在给予高糖刺激后ALDOA表达变化最为显著;建立ALDOA RNA干扰与过表达HepG2肝癌细胞模型,并用Realtime PCR和蛋白免疫印迹法(WB)检测重组细胞ALDOA在mRNA水平以及蛋白水平表达差异,验证过表达和RNA干扰的实验结果。(3)观察ALDOA对肿瘤细胞侵袭和增殖能力的影响,对四株重组细胞HepG2-ALDOA-NC,HepG2-ALDOA,HepG2-shRNA-NC,HepG2-shRNA-ALDOA通过免疫荧光法(IF)和WB检测上皮间质转化(EMT)转移相关标志物蛋白表达变化;Transwell细胞侵袭实验测定细胞侵袭与转移;通过裸鼠皮下移植瘤实验,绘制肿瘤生长曲线;裸鼠尾静脉注射肺转移实验,处死裸鼠后观察肝癌细胞血行转移后肺部组织病变情况;进行了细胞生长曲线的测定,流式细胞仪测凋亡。(4)筛选以ALDOA为治疗靶点的抗肿瘤当归多糖,不同当归多糖组分分别作用HepG2细胞,通过WB检测细胞内ALDOA蛋白水平表达差异,同时观察当归多糖对HepG2细胞增殖的影响;通过HepG2-ALDOA细胞明确活性多糖对ALDOA的特异性作用。结果:(1)在人肝癌组织样本中,与癌旁组织相比,ALDOA在肝癌组织中的表达显著增加,Vimentin与E-cadherin的表达也发生了变化;相关性分析结果显示ALDOA和Vimentin的表达呈正相关,但ALDOA和E-cadherin的表达呈负相关。(2)成功构建了ALDOA过表达和RNA干扰重组细胞模型。(3)构建完成的AIDOA过表达细胞与对照细胞相比,细胞中Vimentin与E-cadherin的表达发生了变化,结果与组织芯片IHC一致;ALDOA过表达细胞的体内肺转移能力与成瘤能力均有所增强;其增殖能力、抗凋亡能力,以及细胞迁移能力明显增强。RNA干扰重组细胞与对照细胞相比,细胞中Vimentin与E-cadherin的表达也同样发生了变化;RNA干扰重组细胞的体内肺转移能力与成瘤能力有所降低;其增殖能力、抗凋亡能力,以及细胞迁移能力相对减弱。(4)当归多糖组分AAPS-2II能明显抑制Hep G2-ALDOA肝癌细胞ALDOA的表达,对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用。结论:(1)ALDOA与肝癌的发生与转移密切相关。(2)构建了ALDOA过表达和RNA干扰重组细胞,发现ALDOA可显著促进肝癌细胞体内、外的增殖和转移,并抑制HepG2细胞凋亡。(3)ALDOA促进HepG2细胞转移与EMT通路相关。(4)当归多糖AAPS-2II可能通过ALDOA产生抗肿瘤作用。