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研究背景颅面畸形是一种最常见的发育畸形,代表了一组与头部和面部骨骼的分化和生长相关的畸形,是一种多因素影响的疾病总称,占所有先天性出生缺陷的三分之一。颅面畸形可能以其他器官或组织参与的综合征形式出现,也可能以只影响颅面部组织器官的非综合征形式出现。常见的颅面部畸形包括唇腭裂、口面裂、颅缝早闭、半面小儿畸形等。颅面部畸形会导致咀嚼、语言、审美和心理问题,从而给受影响的个人和社会带来沉重的负担。目前,综合运用外科手术干预,赝附体修复,正畸治疗等一系列手段,可使颅面畸形的治疗效果,患者颜面美观和口腔功能得到显著的改善,但整体疗效仍然十分有限,且颅面畸形患者多伴有家族遗传病史。颅面畸形的病因包括环境因素和遗传因素两大类。环境因素包括物理、化学、放射、外伤等。尽管许多潜在和确定的环境因素均会影响颅面部发育,但现有研究证明遗传因素是颅面畸形更为重要的致病因素,因此,建立在遗传因素为病因基础的研究对颅面畸形预防和治疗更有价值。本研究项目将以斑马鱼为动物模型,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼Keratin92基因,筛选出Keratin92基因斑马鱼突变体纯合子,研究Keratin92基因对斑马鱼颌面部发育的作用,从发育生物学的角度研究颅面畸形的遗传因素发病机制,并初步探索Keratin92是否通过BMP信号通路调控斑马鱼颌面部骨发育过程。研究目的本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建Keratin92基因缺失型斑马鱼突变体模型,对Keratin92的基因功能进行初步的探讨,并对Keratin92基因缺失的斑马鱼表型进行分析,揭示Keratin92调控颌骨发育的分子机制,阐明Keratin92基因突变导致先天颅面畸形的机制,为颌骨发育分子调控及颅面畸型诊疗提供理论基础和遗传学依据。材料和方法通过网站在Keratin92基因的蛋白编码区(CDS)上设计target site以及检测引物,以gRNA质粒作为模版,通过体外扩增的方式进行Prime STAR PCR,所得产物纯化后体外转录得到Keratin92基因的gRNA。将gRNA与Cas9酶进行配制混合,通过显微注射的方式输入Wild Type(WT)型斑马鱼胚胎1-cell期的动物极。通过测序的方式保留突变的样本胚胎,进行培养至性成熟期后与WT型斑马鱼侧交产下F1代突变体斑马鱼杂合子,再经测序保留稳定遗传的突变体胚胎继续培养至成年期,通过拔鱼鳞测序的方式分别确定每条F1代突变体斑马鱼的突变方式,相同突变方式且为移码突变的F1代斑马鱼自交得到F2代Keratin92突变体斑马鱼纯合子。通过全胚原位杂交技术探究Keratin92基因在WT型斑马鱼发育过程中的表达模式,探索该基因发挥功能的区域和时间;拍摄并记录Keratin92突变体的胚胎发育过程;使用阿尔辛兰-茜素红无酸双染色实验对120Hour Post-Fertilization(hpf)的突变体斑马鱼进行颌骨染色,对其骨骼结构进行分析;将120hpf的突变体斑马鱼进行石蜡切片,切取颌骨部位进行HE染色,分析颌骨软骨细胞的形态结构以及组织排列;通过实时荧光定量PCR实验检测突变体的骨发育相关的基因表达是否受到影响。实验结果我们成功构建出了在Keratin92基因第一个外显子上缺失五个碱基(-AGAGG)且稳定遗传的Keratin92纯合子突变体斑马鱼。全胚原位杂交的实验结果表明Keratin92基因在胚胎早期发育时期广泛表达,24hpf后集中表达在斑马鱼颌骨、咽弓以及肠道部位。Keratin92突变体斑马鱼在胚胎早期发育过程(4.70hpf-8.00hpf)时胚胎发育几乎停滞,该时期同时也时神经嵴早期发育的重要时期。颌骨染色的结果表明,120hpf的突变体斑马鱼具有颌骨发育异常,其梅克尔软骨的宽度增加、两侧舌角骨的夹角角度增大。颌骨切片HE染色的结果显示突变体斑马鱼的颌骨软骨细胞形态结构以及组织排列与WT型并无明显差异。实时荧光定量PCR的结果表明,突变体的颅面结构发育相关基因Dlx2、Zic2a、Fzd4、Dkk1b,成骨标记基因Fgf8a以及软骨发育相关基因Col2a1a、Nkx3.2、PAX9的表达相较与WT型均下调。结论本研究使用CRISPR/Cas9系统成功在斑马鱼体内敲除了Keratin92基因并获得了稳定的遗传,成功构建了斑马鱼Keratin92突变体。研究发现该基因在斑马鱼胚胎早期发育阶段广泛表达,并且在72hpf后集中表达在斑马鱼颌骨及咽弓部位,Keratin92基因的缺失会造成斑马鱼颌骨发育异常,为研究Keratin92基因的相关功能提供了一定的理论和实验基础。同时也证明了通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼上构建颅面畸形模型的可行性。并且,通过这种方法也可以大规模实现临床颅面部疾病相关基因的筛查,为治疗这种遗传相关的颅面部畸形提供新型的治疗方案。