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研究背景和目的:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是一种浆细胞恶性肿瘤,其特征为单克隆免疫球蛋白及骨髓浆细胞异常增生。MM常伴有溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害等临床症状。MM的治疗方式主要包括放疗和化疗、造血干细胞移植。除了传统的化疗药,靶向药物如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米、卡非佐米）和免疫调节剂等都是目前用于MM治疗的一线药物,此外,MM的治疗药物还包括糖皮质激素如地塞米松、强的松等。尽管大部分MM患者病情获得一定程度的缓解,但由于复发、转移及耐药的出现,患者生存期受到显著影响。因此,深入研究骨髓瘤病理分子机制,发现新颖的MM治疗靶标刻不容缓。本课题首先基于基因文库筛选出的YTHDF2（YTH domain family 2）基因构建稳定敲低YTHDF2表达的MM细胞系,进行细胞增殖及细胞周期等表型研究和动物实验的验证。其次,通过m6A（N6-methyladenosine）甲基化的高通量测序寻找YTHDF2可能调控的下游基因,探究其通过m6A甲基化修饰调控MM细胞增殖的潜在机制。本研究拟为MM的治疗提供新的分子靶标寻求新的治疗手段。研究方法:1.采用慢病毒转染体系构建YTHDF2敲低（Knockdown,KD）和过表达（Overexpression,OE）MM细胞株,运用WB（Western blot）实验及荧光显微镜观察验证转染效果。斑点杂交（Dot Blot）实验验证敲低/过表达YTHDF2对MM细胞m6A水平的影响。MTT增殖实验检测YTHDF2-KD细胞和YTHDF2-OE细胞的增殖情况,流式细胞术检测敲低和过表达YTHDF2对细胞有丝分裂周期的影响。通过注射野生型（Wildtype,WT）和ARP1-YTHDF2-KD MM细胞构建免疫缺陷小鼠异种移植瘤模型,研究靶向YTHDF2在体内对MM细胞生长的影响。2.通过m6A-seq library（IP）和RNA-seq library（Input）两个高通量测序文库的比对寻找YTHDF2下游可能存在的靶点,结合MM病人基因文库进一步筛选出YTHDF2与MM 相关的下游靶标 STAT5A（Signal transducer and activator of transcription 5a）。RIP（RNA immunoprecipitation）-qPCR 实验、RT（Real-time）-qPCR 和 WB 实验验证 YTHDF2 对STAT5A mRNA和蛋白表达量的影响。利用mRNA稳定性实验验证YTHDF2对STAT5A mRNA的降解作用。3.构建STAT5A-OE细胞验证STAT5A对MM细胞增殖的影响。通过STAT5A-ChIP（Chromatin immunoprecipitation）测序与RNA测序寻找STAT5A作为转录因子调控的下游基因MAP2K2。4.利用 ChIP-qPCR 实验验证 STAT5A 直接结合 MAP2K2（Mitogen-activated protein kinasekinase2）,并调控其转录,WB 验证 YTHDF2-KD 和 STAT5A-OE 细胞中 MAP2K2、ERK（Extracellular regulated MAP kinase）、p-ERK（phosphorylated Extracellular regulated MAP kinase）的蛋白水平。运用蛋白免疫共沉淀（Cooperation immunoprecipitation,CoIP）实验和RNA干扰实验验证MAP2K2与ERK的相互作用。利用白介素-2（Interleukin-2,IL-2）验证 u-STAT5A（unphosphorylated STAT5A）在对 MAP2K2 的表达抑制中发挥不可或缺的作用。研究结果:1.基于MM患者基因大数据文库高通量筛选出m6A甲基化阅读蛋白YTHDF2,发现其与MM患者的疾病进程密切相关。其次,基因芯片技术、MM患者临床数据证实YTHDF2基因与MM患者的生存率显著相关,YTHDF2高表达MM患者的生存率低于YTHDF2低表达MM患者。接着,YTHDF2基因敲低/过表达稳转MM细胞增殖及细胞周期等表型研究中的实验结果显示敲低YTHDF2能够显著抑制MM细胞的增殖速率,但不是通过调控细胞周期分布引起的。2.m6A甲基化的高通量测序结果显示敲低YTHDF2可导致多种基因表达水平发生变化,结合MM患者基因文库筛选得到STAT5A基因。关于YTHDF2与STAT5A表达相关性的研究结果表明,敲低YTHDF2后,STAT5A的mRNA水平上调,蛋白水平亦是如此,因此初步推测YTHDF2对MM细胞促增殖作用可能是通过调控STAT5A的表达实现的。3.STAT5A-OE细胞与WT细胞相比,STAT5A-OE MM细胞的增殖速率明显下降,提示STAT5A在MM细胞中可能作为一种肿瘤抑制因子存在。4.ChIP测序发现STAT5A可能通过调控MAPK信号通路相关基因的转录抑制其表达,从而调控MM细胞的增殖。结合RNA测序结果,本研究认为MAP2K2在STAT5A抑制MM细胞增殖中发挥重要作用。研究结果发现STAT5A抑制MAP2K2表达,从而抑制ERK的磷酸化,表现为对MM细胞增殖的抑制作用。同时发现其u-STAT5A抑制MAP2K2表达,当STAT5A被磷酸化后会解除其抑制作用。结论:本论文通过探究YTHDF2在MM细胞中的作用,发现了 YTHDF2、STAT5A、MAP2K2和ERK之间的轴向调控作用:YTHDF2识别STAT5A mRNA上的m6A甲基化,促进其降解。u-STAT5A可以抑制MAP2K2转录,降低其表达,导致ERK的磷酸化水平下降,从而在一定程度上抑制MM细胞的增殖。本研究拟为MM的治疗提供新的分子靶标。