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铅属高毒物品,是自然界广泛存在的有毒重金属。我国铅储量丰富,是铅矿开采、冶炼和铅制品生产大国,由于工艺落后,防护简陋,且从业人员众多,铅危害事件（环境铅污染、群体性铅中毒）时有报道。铅对人类和环境所造成的威胁十分严重,长期以来,新发职业性慢性铅中毒病例数一直高居全国职业性慢性化学中毒新发病例数的首位。铅在体内易蓄积,无特殊靶器官,人体对铅的毒性普遍易感,对铅的一般毒性如神经毒性、血液毒性、免疫毒性等研究较为深入,但对其遗传毒性及其作用机制研究有限,铅遗传毒性作用机制仍然不完全清楚。遗传毒性是毒物致癌、致畸、致突变早期生物学事件,毒物的遗传毒性不仅危害毒物接触者本人健康,而且会影响其后代子女的健康。开展铅遗传毒性研究,阐明铅遗传毒性分子机制对于其危害,包括致癌、致畸和致突变危害的预防和控制至关重要。研究目的:1.评估铅对人淋巴母细胞（TK6细胞）的遗传毒性,阐明铅的遗传毒性与铅的氧化应激作用之间的关系。2.研究Nrf2/ARE通路对铅遗传毒性的作用机制。3.研究DNA损伤修复基因启动子甲基化对铅遗传毒性的作用机制。研究方法:1.利用CCK-8实验检测TK6细胞活力,利用染色体畸变实验、免疫荧光法检测γ-H2AX技术和ELISA法检测8-OHdG（DNA氧化性损伤标志物）技术检测铅染毒对TK6细胞染色体及DNA的损伤作用,评估铅的遗传毒性。2.不同剂量铅染毒后,检测TK6细胞内ROS、MDA、GSH、GSSG、SOD含量的变化,阐明铅遗传毒性与铅的氧化应激作用之间的关系。3.不同剂量铅染毒后,利用EMSA法测定TK6细胞Nrf2-ARE结合水平,利用qPCR法和Western-Blot法测定Nrf2、HO-1、Nqo-1、XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD基因的mRNA和蛋白表达水平,利用MSP法测定DNA损伤修复基因XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD的启动子甲基化表达水平,探讨Nrf2/ARE通路和DNA损伤修复基因启动子甲基化对铅遗传毒性的作用机制。研究结果:1.铅染毒会抑制TK6细胞活力,在铅染毒6h、12h、24h后,TK6细胞活力出现明显下降,铅染毒24h后TK6细胞的IC50为:952.8±3.1μmol/L。2.铅染毒会明显损伤TK6细胞染色体和DNA,铅染毒后,TK6细胞染色体畸变数量增加,DNA双链断裂指标γ-H2AX的含量增高,DNA氧化损伤生物标志物8-OHdG的含量上升。染色体和DNA的损伤与铅染毒存在明显的时间-剂量效应。3.铅染毒后,TK6细胞内ROS荧光强度增强,细胞内ROS、MDA、GSSG的含量显著上升,细胞内抗氧化酶GSH、SOD的含量明显下降,TK6细胞氧化应激状态与铅染毒存在明显的时间-剂量依赖性。4.铅染毒促进Nrf2和Nqo-1基因的mRNA表达水平持续增高,HO-1基因的mRNA表达水平先增强后逐渐降低。Nrf2-ARE结合能力随铅染毒浓度和时间的增加而增强。胞核Nrf2蛋白随铅染毒时间延长表达持续上升,胞浆Nrf2蛋白表达持续下降,HO-1蛋白在铅染毒6h时表达快速上升,后随时间延长表达下降,Nqo-1蛋白随铅染毒时间延长表达持续上升。5.铅染毒促进XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD基因启动子甲基化表达持续上升。XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD基因的mRNA的表达水平随铅染毒剂量增加呈现先增强后逐渐降低。XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD蛋白表达水平在铅染毒6h时表达快速上升,后随时间延长表达下降,在铅染毒24h时,hOGG1蛋白表达水平仍显著高于阴性对照组,XRCC1、BRCA1和XPD蛋白表达水平与阴性对照组相比无显著性差异。研究结论:1.铅染毒抑制TK6细胞活力,对染色体和DNA损伤严重,具有明显的遗传毒性作用,铅染毒能持续诱导细胞ROS生成,增加细胞内MDA、GSSG的含量,抑制细胞内抗氧化酶GSH、SOD的活力,导致细胞氧化应激状态增强和DNA氧化性损伤,铅的遗传毒性与铅致细胞氧化应激作用密切相关。2.铅染毒导致细胞氧化应激能诱导Nrf2持续活化,激活胞浆Nrf2蛋白向核内转移,促进Nrf2-ARE结合能力持续上升,下游HO-1基因在铅染毒短时间内表达快速上升,后随染毒时间延长表达逐渐下降,Nqo-1基因表达持续上升,拮抗铅染毒对细胞的氧化损伤。铅染毒激活Nrf2/ARE通路对铅的遗传毒性发挥重要的防御保护作用。3.铅染毒导致DNA氧化性损伤能激活细胞DNA损伤修复系统,诱导XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD基因启动子甲基化水平随铅染毒浓度增加和染毒时间延长而表达上升,XRCC1、hOGG1、BRCA1和XPD基因的mRNA和蛋白表达水平随铅染毒剂量增加呈先增强后减弱。铅染毒诱导DNA损伤修复基因启动子甲基化水平升高导致DNA损伤修复能力下降可能是促进铅遗传毒性发生的原因之一。本课题“铅对人淋巴母细胞遗传毒性分子机制的研究”初步形成的铅遗传毒性机制设想见图1。