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烟草是我国重要的经济作物,由青枯雷尔氏菌引起的青枯病是烟草重要的土传性细菌病害,是影响烟草产量和品质的关键因子之一,目前还没有行之有效的化学防治手段。解决青枯病最有效的手段是培育抗病品种,但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在周期长、抗性与高产优质负相关等问题,利用分子育种技术培育高产优质抗青枯病烟草品种是有效解决烟草受青枯病侵染的有效途径。本研究在已得到的烟草根特异基因及特异启动子的基础上,克隆来自烟草自身的终止子,利用抗生素自我删除系统构建了四个单价载体及特异启动子携带抗病基因的植物表达载体,转入烟草进行功能验证;并分析了解特异启动子不同区域的功能,可应用于转基因安全方面的研究,结果证明了通过转基因技术可有效提高烟草抗青枯病性。主要研究结果如下:1、根据实验室已克隆得到的烟草根特异NtR19基因,设计引物,从烟草品种K326中克隆终止子T19的序列,获得T19终止子,替换植物表达载体pBI121-GUSA(带GUS报告基因)的终止子(Tnos)序列,构建载体pBI121-GUSA-T19,将两种载体通过农杆菌介导的方法转化烟草,对获得的转基因烟草进行分子检测及GUS活性组织染色分析,结果显示根特异基因终止子(T19)能完全终止GUS基因的表达,同时也说明NtR19基因全长mRNA的3’UTR可以作为终止子加以利用,使用来自烟草的终止子能在一定程度上解决外源基因安全性的问题,这对转基因的安全性提供了资源基础。2、本实验室已利用Cre/loxP系统构建了抗生素自我删除表达载体p35S-]oxP-GUS,用不同的表达启动子(NtR12,NtR2,PP1),抗病基因(Rip,Glu,Chi,NPR1)及来自烟草本身终止子(T19,Tp6)连接构建到中间载体pSPROK上,替换抗生素自我删除表达载体p35S-loxP-GUS的35S启动子,构建了单价载体,分别命名为:pLOXP-NtR12-Rip-T19、pLOXP-NtR12-Chi-T19、pLOXP-NtR2-NPR1-Tp6、pLOXP-PP1-Glu-Tp6,将这些表达载体转化获得转基因烟草可为烟草抗青枯病基因工程奠定基础。3、为了获得抗烟草青枯病转基因烟草品种,本实验室通过已经克隆的特异启动子NtR2,抗病基因NPR1及烟草自身终止子Tp6,设计引物,构建植物表达载体pLMAR-NtR2-NPR1-Tp6,将载体通过叶盘法方法转化烟草,对获得的转基因烟草进行分子检测,同时对转基因植株进行青枯病菌的接种鉴定,表明终止子Tp6能使NPR1基因正常转录终止,启动子能驱动抗病基因NPR1的表达,并且实现只在烟草根部表达,转基因植株抗青枯病能力较非转基因植株抗性强。4、根据本实验室已经克隆得到的烟草特异启动子NtR6序列,构建了从3’起携带不同长度NtR6启动子片段的缺失系列载体,pBI121GUSA-NtR6-1735,pBI121GUSA-NtR6-1293;pBI121GUSA-NtR6-973;pBI121GUSA-NtR6-685;pBI121GUSA-NtR6-350。通过PCR检测筛选阳性转基因植株,GUS染色活性分析启动子不同区域的功能。结果表明NtR6启动子-973bp以上片段具有完整驱动GUS基因在根部特异表达的功能;-350bp～-685bp区段可驱动GUS在叶片和根表达,而在茎不表达,显示-685bp～-973bp具有抑制叶片表达功能的顺式元件,而0～-350bp含有在根和叶特异表达的顺式元件;由于0～-350bp使根特异表达出现减弱,推测-350bp～685bp区段含有一个增强根表达的增强子元件。研究初步揭示了 NtR6启动子的构建和功能。