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鸡是最重要的农业经济动物之一，为满足人民对鸡肉产品不断增长的需求，育种工作者对鸡体重和生长速度进行高强度的选择，其生长速度和产肉量明显提高，但高强度的选择，带来了腹脂的过度沉积，过量的腹部脂肪沉积降低了饲料利用率，增加饲养成本，降低分割肉产量，降低种鸡产蛋率、受精率和孵化率，可能诱导脂肪肝综合症的发生，肉鸡屠宰加工过程腹脂作为废弃物丢弃，增加了废弃物处理负担。改善腹脂过度沉积是我国鸡也亟待解决的问题。腹部脂肪沉积受遗传、营养和激素的影响。然而，目前对鸡腹部脂肪沉积的研究还不够系统和深入。本研究分离出固始鸡原代腹部脂肪细胞，并诱导分化鸡腹部前脂肪细胞0d(Ab-Pre)和分化10d的脂肪细胞(Ab-Ad)，构建了脂肪分化模型。对Ab-Pre和Ab-Ad组进行了转录组测序，筛选出与鸡腹部脂肪增殖分化相关的候选基因，并对候选基因SLC22A16进行了功能鉴定，通过干扰和过表达技术，从细胞水平深入探讨SLC22A16对鸡腹部脂肪沉积的转录调控作用。
1、鸡腹部脂肪细胞分化关键基因的筛选与验证
利用14日龄固始鸡腹部脂肪组织分离培养原代腹部脂肪细胞，对诱导分化前后(0d和10d)的腹部脂肪细胞进行RNA-seq，共筛选到4693个差异基因，其中显著下调基因2797个，包括SCD、INSIG1、ELOVL5、PPARA、ACSL5和SOCS3等。显著上调基因1896个，包括SLC22A16、LPIN1、KLF5、COL6A1、FOXO4和ACOT13等。GO和KEGG富集分析表明，这些差异表达的基因富集于类固醇生物合成、糖酵解/糖异生途径、ECM受体相互作用、脂肪酸生物合成等信号通路。其中SLC22A16在腹部脂肪细胞分化后期高表达。
2、SLC22A16对鸡腹部脂肪细胞增殖分化功能的研究
构建SLC22A16pcDNA3.1-EGFP过表达载体，EdU染色及CCK8试验结果表明，在鸡ICP1细胞中过表达SLC22A16，显著促进细胞增殖，细胞活性显著上升(P＜0.05);油红O染色结果显示，脂滴含量显著上升(P＜0.01)。利用RNA干扰技术在ICP1细胞中对SLC22A16进行干扰，EdU染色及CCK8试验结果表明，干扰SLC22A16，显著抑制细胞增殖，细胞活性显著下降(P＜0.05);油红O染色结果显示，干扰SLC22A16，脂滴含量显著下降(P＜0.05)。
过表达载体pcDNA3.1-SLC22A16转染原代鸡腹部前脂肪细胞48h后，收集细胞，结果表明，在原代鸡腹部脂肪细胞中过表达SLC22A16后，细胞增殖相关基因表达量上升(P＜0.05)，流式细胞术表明G1期细胞较少，S期细胞显著增多(P＜0.01);脂肪细胞分化标志基因显著上升(P＜0.05);胞内甘油三酯含量显著增多(P＜0.01);。SLC22A16干扰片段转染原代鸡腹部前脂肪细胞48h后，细胞增殖相关基因表达量下降(P＜0.05)，流式细胞术表明抑制鸡腹部脂肪细胞从G1期进入S期(P＜0.001)脂肪细胞分化标志基因显著下降(P＜0.05);胞内甘油三酯含量显著减少(P＜0.05)。
3、鸡SLC22A16核心启动子区的鉴定及甲基化水平研究
本试验克隆得到SLC22A16基因启动子区域的不同截短体序列，双荧光素酶报告系统鉴定到SLC22A16核心启动子区域为561bp～-1074bp，转录预测的SLC22A16-561bp～-1074bp可能存在促进转录作用的转录因子，Sp-1、C/EBPα、Oct-1等转录因子;-1074bp～-1656bp区域可能存在抑制转录作用的转录因子，REV-ErbA、AP-2α等转录因子。同时，生物信息分析发现在启动子区-55bp～-357bp处存在一个302bp的CpG岛，然后利用亚硫酸盐测序技术检测腹部前脂肪细胞分化0d和分化4d时SLC22A16的甲基化水平，结果在腹部脂肪细胞分化0d和分化4d时的甲基化水平分别为90％、20％，与基因表达量负相关。
综上所述，本研究通过对固始鸡腹部诱导分化前后的脂肪细胞转录组测序筛选到SLC22A16在脂肪细胞分化后高表达。试验表明鸡SLC22A16基因促进鸡腹部脂肪细胞的增殖与分化，鸡腹部脂肪细胞的分化水平受SLC22A16启动子区DNA甲基化的影响，启动子区的转录因子可能参与鸡腹部脂肪细胞的增殖与分化，为解析SLC22A16在鸡腹部脂肪沉积中的调控机制提供理论基础。
1、鸡腹部脂肪细胞分化关键基因的筛选与验证
利用14日龄固始鸡腹部脂肪组织分离培养原代腹部脂肪细胞，对诱导分化前后(0d和10d)的腹部脂肪细胞进行RNA-seq，共筛选到4693个差异基因，其中显著下调基因2797个，包括SCD、INSIG1、ELOVL5、PPARA、ACSL5和SOCS3等。显著上调基因1896个，包括SLC22A16、LPIN1、KLF5、COL6A1、FOXO4和ACOT13等。GO和KEGG富集分析表明，这些差异表达的基因富集于类固醇生物合成、糖酵解/糖异生途径、ECM受体相互作用、脂肪酸生物合成等信号通路。其中SLC22A16在腹部脂肪细胞分化后期高表达。
2、SLC22A16对鸡腹部脂肪细胞增殖分化功能的研究
构建SLC22A16pcDNA3.1-EGFP过表达载体，EdU染色及CCK8试验结果表明，在鸡ICP1细胞中过表达SLC22A16，显著促进细胞增殖，细胞活性显著上升(P＜0.05);油红O染色结果显示，脂滴含量显著上升(P＜0.01)。利用RNA干扰技术在ICP1细胞中对SLC22A16进行干扰，EdU染色及CCK8试验结果表明，干扰SLC22A16，显著抑制细胞增殖，细胞活性显著下降(P＜0.05);油红O染色结果显示，干扰SLC22A16，脂滴含量显著下降(P＜0.05)。
过表达载体pcDNA3.1-SLC22A16转染原代鸡腹部前脂肪细胞48h后，收集细胞，结果表明，在原代鸡腹部脂肪细胞中过表达SLC22A16后，细胞增殖相关基因表达量上升(P＜0.05)，流式细胞术表明G1期细胞较少，S期细胞显著增多(P＜0.01);脂肪细胞分化标志基因显著上升(P＜0.05);胞内甘油三酯含量显著增多(P＜0.01);。SLC22A16干扰片段转染原代鸡腹部前脂肪细胞48h后，细胞增殖相关基因表达量下降(P＜0.05)，流式细胞术表明抑制鸡腹部脂肪细胞从G1期进入S期(P＜0.001)脂肪细胞分化标志基因显著下降(P＜0.05);胞内甘油三酯含量显著减少(P＜0.05)。
3、鸡SLC22A16核心启动子区的鉴定及甲基化水平研究
本试验克隆得到SLC22A16基因启动子区域的不同截短体序列，双荧光素酶报告系统鉴定到SLC22A16核心启动子区域为561bp～-1074bp，转录预测的SLC22A16-561bp～-1074bp可能存在促进转录作用的转录因子，Sp-1、C/EBPα、Oct-1等转录因子;-1074bp～-1656bp区域可能存在抑制转录作用的转录因子，REV-ErbA、AP-2α等转录因子。同时，生物信息分析发现在启动子区-55bp～-357bp处存在一个302bp的CpG岛，然后利用亚硫酸盐测序技术检测腹部前脂肪细胞分化0d和分化4d时SLC22A16的甲基化水平，结果在腹部脂肪细胞分化0d和分化4d时的甲基化水平分别为90％、20％，与基因表达量负相关。
综上所述，本研究通过对固始鸡腹部诱导分化前后的脂肪细胞转录组测序筛选到SLC22A16在脂肪细胞分化后高表达。试验表明鸡SLC22A16基因促进鸡腹部脂肪细胞的增殖与分化，鸡腹部脂肪细胞的分化水平受SLC22A16启动子区DNA甲基化的影响，启动子区的转录因子可能参与鸡腹部脂肪细胞的增殖与分化，为解析SLC22A16在鸡腹部脂肪沉积中的调控机制提供理论基础。