家兔繁殖性能受多种因素的影响，除营养因素外，母兔卵巢中卵泡发育的优劣很大程度上影响母畜的发情、排卵和妊娠等繁殖性能。卵巢颗粒细胞(GCS)在卵泡发育过程中起着非常重要的作用，颗粒细胞的增殖以及孕酮、雌二醇的分泌直接影响卵泡的发育成熟，进而影响家兔的繁殖性能。组织蛋白酶S(CTSS)和组织蛋白酶B(CTSB)都是半胱氨酸组织蛋白酶家族的成员。在家畜繁殖、人类生育以及肿瘤生长等生理和病理过程中都起着至关重要的作用，但是CTSB/CTSS基因在家兔颗粒细胞(GCS)发育中的功能仍然未知。本研究通过分离鉴定家兔原代颗粒细胞，利用重组腺病毒和siRNA技术，研究CTSB/CTSS基因对家兔颗粒细胞的增殖、凋亡及激素分泌的影响作用，探究CTSB/CTSS基因在家兔繁殖过程中的调控作用，主要研究结果如下:
　　1、通过RT-PCR技术克隆得到家兔CTSB/CTSS基因CDS区全长，CTSB基因CDS区长度为1020bp，CTSS基因CDS区长度为1023bp。组织表达分析结果表明，CTSB在腹脂和肝脏中的表达量最高，其次是肌肉，子宫组织和脾脏最低;CTSS在脾脏中的表达量最高，其次是心脏和肝脏，子宫最低。
　　2、分离培养家兔原代颗粒细胞，并通过HE染色和FSHR免疫荧光方法对家兔颗粒细胞进行鉴定，细胞呈梭形、椭圆形或多突状，胞核大、圆，核仁明显，细胞质颗粒丰富、均匀，细胞间伪足连接紧密。FSHR荧光颗粒细胞占99％，家兔颗粒细胞分离纯度达99％，家兔颗粒细胞分离成功。
　　3、构建家兔CTSB/CTSS基因重组腺病毒超表达载体，转染293A细胞后包装扩繁得到超表达腺病毒Ad-CTSB/CTSS，并确定家兔颗粒细胞中最佳MOI为40。RT-qPCR检测结果表明:Ad-CTSB/CTSS重组腺病毒感染家兔颗粒细胞48h后，CTSB及CTSS均超表达300倍以上。同时，分别设计三对特异靶向家兔CTSB/CTSS的siRNA，转染家兔原代颗粒细胞48h后，筛选得到si-CTSB-118及si-CTSS-127片段干扰效果最好，干扰效率达到80％。
　　4、在家兔原代颗粒细胞中过表达和干扰CTSB/CTSS后，CTSB通过增加抗凋亡(BCL2)和增殖(PCNA)相关基因的表达来促进GCS的增殖，同时通过降低促凋亡基因(BAX)的表达来抑制GCS的凋亡。此外，我们发现CTSB还可以通过调节CTP11A1和CYP19A1的表达来促进颗粒细胞孕酮和雌二醇的分泌。与CTSB基因类似，CTSS的过表达可以通过增加STAR和CYP19A1的表达而显著促进孕酮(P4)和雌激素(E2)的分泌(P＜0.05)。同时，CTSS的过表达通过上调增殖相关基因(PCNA)和抗凋亡基因(BCL2)，下调促凋亡基因BAX的表达，促进GCS的增值和减少GCS的凋亡。
　　综上所述，本研究克隆得到家兔CTSB/CTSS基因的CDS区，并在家兔原代卵巢颗粒细胞中开展了功能验证。研究结果表明:CTSB/CTSS基因在调节家兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡及激素分泌过程中发挥着重要的调控作用，研究结果为进一步认识家兔繁殖的分子调控机制及生理代谢通路提供了基础依据。