灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌门的模式药用真菌,已有2000多年的应用历史,具有显著的抗肿瘤、抗衰老、降血糖、抗高血压、免疫调节和改善记忆力等作用。目前对于灵芝有效成分的研究主要集中于多糖和三萜类化合物,而对于灵芝中挥发性萜类研究非常匮乏。通过对灵芝基因组数据进行挖掘,发现赤芝(Ganoderma lucidum)编码23 个倍半萜合酶,紫芝(Ganoderma sinense)编码 26 个倍半萜合酶。本论文对所有的赤芝倍半萜合酶和5个紫芝倍半萜合酶进行了研究。首先对灵芝倍半萜合酶进行系统进化分析,发现灵芝倍半萜合酶可以分为5个进化分枝。多重序列比对分析发现,所有灵芝倍半萜合酶都含有保守的NES/DET基序,进化分支Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ中的灵芝倍半萜合酶含有保守的DDXXD基序,该基序在进化分Ⅴ中的保守性不强,在11个灵芝倍半萜合酶中有两个含有DDXXD,6个含DDXXXXD序列,3个含有DDXXXXXD序列。赤芝倍半萜合酶基因分布在12条染色体中的9条,其中在4,7和8号染色体上分布较多,串联重复是这些灵芝倍半萜合酶基因家族扩增的主要方式。在酵母表达体系中对23个赤倍半萜合酶基因进行诱导表达,利用固相微萃取收集挥发性物质,并通过GC-MS对其催化产物进行检测,发现其中16个赤芝倍半萜合酶具有催化活性,其中GL22395仅催化合成两种产物;GL20791的产物最多,可催化合成24种不同的倍半萜。16个赤芝倍半萜合酶共催化产生80种倍半萜物质,高丰度产物有25种,通过与标准品比对确定了 8个物质的结构。这些倍半萜大多是在灵芝中首次报道,其中9种倍半萜化合物已报道具有显著的药理活性。在大肠杆菌中对5个紫芝倍半萜合酶基因进行异源表达,通过SDS-PAGE对其蛋白表达情况进行检测。GC-MS分析发现,仅有3个酶具有催化活性,共合成15种倍半萜类化合物。在大肠杆菌中表达赤芝倍半萜合酶GL26009和GL25909,并分离纯化蛋白进行体外酶活性检测。结果表明GL26009和GL25909在体外酶活检测体系中合成的产物与其在酵母或大肠杆菌体内的催化产物大致相同,但产物的丰度会有所变化。GL26009在三种体系中合成的高丰度产物都含有a-Cadinol,此外,在体外反应体系中,GL26009还催化产生另外两种高丰度倍半萜δ-cadinene和Nerolidol。GL25909在大肠杆菌和酵母体内体系中合成的高丰度产物为T-Muurolol,但在体外反应体系中合成的高峰度产物为α-Cadinol。上述研究结果表明反应的微环境会对倍半萜合酶的产物特异性产生影响。从合成机制角度来看,灵芝倍半萜合酶主要涉及C1-C6,C1-C10,Cl-C11环化。进化枝Ⅰ和Ⅱ的灵芝倍半萜合酶主要通过1-10环化机制生成单环或双环的倍半萜化合物。进化枝Ⅲ灵芝倍半萜合酶均能产生经由Cl-C11环化机制形成的运-Caryophyllen,该进化枝高丰度产物的催化机制尚不明确。进化枝Ⅳ的灵芝倍半萜合酶被认为是γ-Cadinene合酶,该产物被认为是FPP经由C1-C10或C1-C6环化机制形成。进化枝V涉及C1-C6和C1-C10等环化机制。灵芝倍半萜合酶的功能鉴定将推动灵芝倍半萜合酶的结构和功能的相关性研究,揭示其催化活性的分子机制和产物多样性的形成机制,为通过酶工程技术改良酶的催化活性生产稀有或新型倍半萜类化合物奠定基础,从而促进灵芝倍半萜类药物的研发。