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目的:获取纯化的白纹伊蚊(广州株)唾液34K2重组蛋白,体外探讨其在DENV2感染人角质形成细胞(Haca T)中可能的生物学功能。方法:IPTG诱导p ET-28-34K2/BL21(DE3)重组菌,12%SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式和分子量大小,镍柱亲和层析法纯化34K2重组蛋白(r Ab-34K2),免疫印迹(Western blotting)法对重组蛋白的特异性进行鉴定;实时无标记细胞动态分析法(RTCA)监测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)对Haca T细胞生长的影响及对DENV2(MOI=1)感染Haca T细胞引发细胞病变(CPE)效应的影响;q RT-PCR实时检测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)对DENV2(MOI=1/0.1)感染Haca T细胞后病毒核酸、IFN-α/β、IL-1β、TNF-α、及IL-10的m RNA的变化;流式细胞术(FACS)检测r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)在DENV2(MOI=1)感染前后Haca T细胞凋亡的影响。结果:r Ab-34K2重组蛋白以包涵体形式表达,经尿素变复性后,亲和层析法可获得纯化的r Ab-34K2蛋白,蛋白浓度为350μg/m L;RTCA结果显示r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、5μg/m L、10μg/m L)对人角质形成细胞(Haca T)的生长无明显影响;在DENV2(MOI=1)时,含10μg/m L r Ab-34K2蛋白组细胞指数(CI)峰值较病毒对照组降低1.3798倍(P<0.05),CIT50(到达50%CI值时间)较对照组缩短5.9小时(P<0.05);胞内DENV2 NS1核酸片段检测显示:MOI=1时,感染12h各组胞内病毒核酸表达较高,随后逐渐降低,感染36h时r Ab-34K2蛋白(1μg/m L、10μg/m L)组显著高于单纯DENV2感染组(其中1μg/m L组高于对照组2.6509倍,P<0.05;10μg/m L组高于对照组3.5527倍,P<0.01);在MOI=0.1时,感染48h、60h、70h后r Ab-34K2蛋白组胞内病毒核酸水平均较病毒对照组显著增高(其中48h时1μg/m L组高于对照组2.3333倍,P<0.001,10μg/m L组高于对照组3.625倍,P<0.001;60h时1μg/m L组高于对照组2.7778倍,P<0.001,10μg/m L组高于对照组4倍,P<0.001;70h时1μg/m L组高于对照组2.8846倍,P<0.001,10μg/m L组高于对照组4.1538倍,P<0.001);检测MOI=1感染模型中细胞因子的情况为:感染24h r Ab-34K2蛋白组IFN-α/β细胞因子的相对表达量显著低于病毒对照组(其中IFN-α:1μg/m L组低于病毒对照组1.7512倍,P<0.05;10μg/m L组低于病毒对照组2.2531倍,P<0.05;IFN-β:1μg/m L组低于病毒对照组3.7380倍,P<0.01;10μg/m L组低于病毒对照组4.7230倍,P<0.01);IL-1β相对表达量均显著上调,1μg/m L组高于病毒对照组5.6929倍,P<0.001;10μg/m L组高于病毒对照组3.9384倍,P<0.001;TNF-α的相对表达量有下调趋势,仅1μg/m L r Ab-34K2蛋白组与病毒对照组具有统计学差异(低于病毒对照组1.8294倍,P<0.05);IL-10的相对表达量有上调趋势,与病毒对照组无统计学差异;细胞凋亡检测结果显示r Ab-34K2(1μg/m L、10μg/m L)处理后各组间凋亡率变化无统计学差异,但感染DENV2(MOI=1)24h后r Ab-34K2蛋白组较DENV2对照组细胞凋亡率显著增多(1μg/m L组凋亡率为(9.1767±2.6303)%,较对照组高2.1989倍,P<0.05;10μg/m L组凋亡率为(10.6633±2.8243)%,较对照组高2.5551倍,P<0.05)。结论:成功纯化获得白纹伊蚊唾液34K2原核重组蛋白,该重组蛋白可促进DENV2在Haca T细胞中增殖、CPE和引发细胞凋亡;r Ab-34K2蛋白可促进感染细胞表达IL-1β并调控IFN-α/β的产生。该实验结果为深入探讨白纹伊蚊唾液34K2蛋白在DENV2感染中的生物学功能提供了一定的实验证据。