结核病和人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染是全球最致命的慢性感染疾病。结核是HIV感染者发病率和死亡率升高的主要原因,也更容易在HIV感染人群中进行播散。据WHO统计报告,2013年全球新增结核病人900万,其中110万(13%)共感染HIV；全球结核死亡人数150万,其中1/4为合并感染HIV致死。在宿主中,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)和HIV彼此加强相互作用,加快免疫功能的弱化或丧失。结核潜伏感染者,一旦再感染HIV,会加速破坏机体免疫系统,主要使CD4+T淋巴细胞的功能下降和数量减少,激活原本受抑制的MTB,使之更容易发展成活动性结核。同时,MTB通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)促进HIV的转录,加速病毒增殖,促使病情恶化。目前,MTB/HIV双重感染者的治疗主要是异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗的结合,其疗程长,多种药物相互作用,药物重叠的毒副作用大,易产生耐药性,病人服药依从性差,对这两种疾病同时有效的药物稀缺,整合异烟肼预防治疗与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战,以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此,亟需开发针对MTB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗MTB/HIV共感染的主要免疫机制是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明,抗原特异性CD8+T细胞在控制MTB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+T细胞通过以下两种途径来发挥作用：1)发挥细胞毒作用,通过穿孔素和颗粒酶B (granzyme B, GrB)途径直接杀伤感染靶细胞；2)释放Thl型细胞因子,如干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a, TNF-a),抑制病原体复制,促进巨噬细胞清除胞内病原体。然而,在MTB/HIV共感染者体内,其免疫功能明显紊乱,表现为T细胞增殖反应下降,效应CD8+T细胞数量和反应水平均很低,白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)和IFN-γ产生显著减少。因此,通过过继转移大量效应CD8+T细胞至MTB/HIV共感染者体内,可增强其抗MTB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗MTB和HIV感染中显示了巨大潜力。Kitsukawa等利用灭活的结核菌体外致敏PBL,将其回输给多药耐药肺结核患者,取得良好疗效。Lieberman等将患者自体HIV特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)过继回输治疗6例HIV感染者,最初2周所有患者CD4计数增加,5名患者血浆病毒血症减少。24周后,2名患者的HIV病毒负载继续减少,另1名患者CD4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景,但这种方法的广泛应用却存在许多障碍。首先,我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞,因为此时CTL反应是不断消耗的；接受长期治疗的个体也是如此,因为随着病原体负载减少,针对病原体的CTL反应也减少。另外,从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的,很难扩增。即使可以扩增,回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体(T cell receptor, TCR)基因修饰初始T细胞,人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力,短期内获得大量效应T细胞,则可有效解决这一问题。我们已经利用结核分枝杆菌38KDa抗原体外刺激正常人外周血CD4+和CD8+T细胞,获得38KDa抗原特异TCR,转导初始T细胞,修饰的T细胞具有显著的体外抗结核抗原活性。HIV-1 gag特异性TCR基因修饰CD8+T细胞的体外和体内活性也有报道。但是,用MTB和HIV-1抗原双特异的TCR对T细胞进行基因修饰尚未见报道。有研究者提出,在人初始T细胞池中,不同特异性的TCR种类<108,而潜在外源肽>1015,因此,TCR的数量与大量潜在的外源肽-MHC复合物相比,是相形见绌的。适应性T细胞免疫要求每个T细胞都能识别大量与细胞异常相关的潜在抗原肽,这种现象可以由T细胞的交叉反应性来解释。最近报道的从I型糖尿病患者分离的1E6 TCR具有非常大的交叉反应性。表达1E6 TCR的T细胞除了识别前胰岛素原来源的HLA-A*0201限制性PPI15-24肽(ALWGPDPAAA)以外,还至少对130万个十肽产生反应,反应强度与PPI15-24一样强烈。在这些大量肽中,活化表达1E6 TCR的T细胞时,RQFGPDFPTI比PPI15-24的活性强100倍以上,尽管它与PPI15-24在组成上有七个氨基酸不一致。因此,我们完全有理由相信可以找到一个单一TCR同时识别两种抗原肽。本文首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染患者的免疫治疗提供新的思路。利用分别负载MTB肽Ag85B199-207 (KLVANNTRL)和HIV-1肽Env120-128 (KLTPLCVTL)的树突状细胞(dendritic cell, DC)反复刺激HLA-A*0201型健康人外周血CD8+T细胞,通过互补决定区3 (complementarity determining region 3, CDR3)谱型分析,筛选出同时对Ag85B 199-207和Env120-128特异的单一TCR,通过逆转录病毒载体将双特异TCR基因转导至普通CD8+T细胞中使其表达。研究结果显示,双特异TCR基因修饰的CD8+T细胞既可针对Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、 TNF-α和GrB分泌及特异性杀伤,同时也可针对Env120-128产生显著的效应反应。本研究为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。方法1.筛选Ag85B199-207和Env120-128双特异TCR1)采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);2) PBMC贴壁培养2h后,吸出悬浮细胞,往贴壁细胞中加入100ng/mL重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和100 ng/mL重组人白细胞介素-4 (recombinant human interleukin-4, rhIL-4)诱导DC；3)MTB肽Ag85B199-207 (50 μg/mL)和HIV-1肽Env120-128 (50μg/mL)分别冲击致敏DC；4)利用分别负载Ag85B199-207和Env120-128抗原肽的DC诱导抗原特异T细胞发生克隆扩增；5)经过两轮刺激后,磁珠分选CD8+T细胞,提取mRNA,逆转录为cDNA；6)CDR3谱型分析检测刺激前后CDR3谱型,找出刺激后均呈单克隆增生的Ag85B199-207和Env120-128双特异的TCRα、β基因家族。2.重组逆转录病毒载体构建与病毒滴度测定1)根据NCBI网站GeneBank报道的人TCR α、β基因家族上游可变区(variable region, V)和下游恒定区(constant region, C)基因序列,设计TCR α和β链全长基因上、下游引物,扩增出Ag85B199-207和Env120-128双特异的α17和p15基因；2)根据文献报道的影响外源TCR基因表达和功能的C区9个关键氨基酸序列,分别设计α和β链C区突变位点上、下游引物,利用重组PCR方法将TCRα、β链C区9个关键氨基酸进行替换；3)利用重组PCR技术,将TCRα和p基因通过自剪切多肽P2A连接,测序鉴定正确后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；4)采用脂质体转染法,将重组逆转录病毒表达载体pMX-β 15-P2A-α 17-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞；5)收集转染后48 h病毒上清,低温超速离心浓缩纯化重组病毒,分装后保存于-80℃;6)重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测其感染性滴度,计算公式：病毒感染性滴度(GFU/mL)=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(mL)。3.TCR基因修饰CD8+T细胞1)采用Ficoll密度梯度离心法,分离HLA-A*0201型健康人外周血PBMC;2)磁珠分选CD8+T细胞；3)联合使用抗CD3 (1μg/mL)、抗CD28 (1μg/mL)单抗和IL-2 (100U/mL)活化刺激分选出的CD8+T细胞；4)以最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI),,即MOI=13将重组逆转录病毒pMX-β15-P2A-α17-IRES-GFP感染CD8+T细胞；5)IL-2刺激感染后的CD8+T细胞；6)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的GFP表达阳性率；7)流式细胞术检测病毒感染后CD8+T细胞的MHC dextramer阳性率；8)实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测病毒感染后CD8+T细胞的β15-P2A-α17的基因水平。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性测定按已摸索好的效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207或H1V-1肽Env120-128的DC共培养。实验组设置如下：① Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原肽的DC; ②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC;③NV+DC-HW：未转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC；⑤ Vector+DC-HIV:空载体转染CD8+T细胞+负载HIV-1肽Envi20-128的DC;⑥ Vector plus TCR+DC-CMV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载CMV肽pp65495-503的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载MTB肽Ag85B199-207的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-HIV:TCR基因修饰CD8+T细胞+负载HIV-1肽Env120-128的DC。利用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、GrB的分泌水平；利用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmuno assay, TRFIA)检测CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性；利用ELISA检测TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ分泌的剂量效应；利用胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining, ICS)检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性测定按已摸索好的E：T,将TCR基因修饰CD8+T细胞与转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养。实验组设置如下：①Vector plus TCR+DC:TCR基因修饰CD8+T细胞+未负载抗原的DC;②NV+DC-MTB:未转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;③NV+DC-Env:未转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；④Vector+DC-MTB:空载体转染CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC;⑤ Vector+DC-Env:空载体转染CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC；⑥ Vector plus TCR+DC-OVA:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCI-OVA质粒的DC; ⑦ Vector plus TCR+DC-MTB:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒的DC; ⑧ Vector plus TCR+DC-Env:TCR基因修饰CD8+T细胞+转染pCAGGS-Env质粒的DC。利用ELISA检测CD8+T细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、 GrB的分泌水平;利用TRFIA检测CD8+T细胞对负载抗原DC的杀伤活性。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定接种不表达TCR的Jurkat T细胞系J.RT3-T3.5细胞,按MOI为0、1、5、10、20、50分别加入重组逆转录病毒浓缩液,测定最适MOI值。按最适MOI值加入病毒感染J.RT3-T3.5细胞,与负载不同浓度(0、0.01、0.1、1、10μg/mL)的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,标记APC-CD69抗体,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞的CD69表达。7.统计学分析采用Windows SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。所有计量资料用平均值±标准差(x±s)表示;采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较CD8+T细胞的细胞因子分泌水平和杀伤水平,方差不齐时采用Welch进行校正；多重比较方差齐时用LSD法,方差不齐时用Dunnett T3法。检验水准a=0.05,双侧检验。结果1.分析抗原肽刺激前后CDR3谱型,筛选出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异TCR通过对CDR3谱型进行分析发现,抗原肽刺激前健康志愿者外周血T细胞各TCR Vα (α chain variable gene)、Vβ (β chain variable gene)基因家族CDR3谱型均呈8个或8个以上峰型的高斯分布,表现为多克隆性。而抗原肽刺激后,部分TCR基因家族的CDR3谱型发生改变,呈偏态分布甚至单峰分布,表明这些家族是因为抗原肽的持续刺激而引起的寡克隆或单克隆增生。通过比较刺激前、后的CDR3谱型,我们在CD8+T细胞中找到了刺激前为多克隆,刺激后呈单克隆扩增,针对MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128都特异的Vα17和Vβ15基因家族。2.构建重组逆转录病毒表达载体成功扩增出MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128双特异的α17和β15全长基因片段,将其克隆至pGEM-T载体后测序鉴定,其V、C区DNA序列与GeneBank报道的序列完全一致。利用重组PCR技术,将人Cα、Cβ区9个关键位点的氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸,扩增出hVβ15mCβ-P2A-hVα17mCα融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP载体,构建重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ5mCβ-P2 A-hVα17mCα-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将上述表达质粒与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,收集48 h病毒上清,经低温超速离心浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测NIH3T3细胞GFP表达阳性率,经计算,重组病毒滴度为1.08×l08GFU/mL。3.TCR基因修饰CD8+T细胞按MOI=13,将重组逆转录病毒颗粒感染CD8+T细胞,感染5天后,在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,利用流式细胞术检测CD8+T细胞的dextramer阳性率。结果显示,在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光,TCR基因修饰CD8+T细胞的MTB dextramer和HIV-1 dextramer双阳性率约为10%。收集感染5天后的CD8+T细胞,提取RNA,并逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TCR基因修饰CD8+T细胞的β15-P2A-a17的基因表达水平,结果显示,TCR载体转染组β15-P2A-α17的基因水平显著高于未转染组和空载体转染组。4.TCR基因修饰CD8+T细胞针对外源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-y分泌水平按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的IFN-y分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=50668.981,P=0.000；F=4097.071,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(598.530 ± 3.621 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(323.584 ± 6.870 pg/mL)的IFN-y分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞的TNF-α分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的TNF-a分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2173.051, P=0.000; F=393.708, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(566.531±19.548 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(354.622 ± 28.604 pg/mL)的TNF-a分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞的GrB分泌水平按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24 h,ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=2757.830,P=0.000; F=3601.843,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(413.818 ± 12.507 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-HIV组(375.823 ± 9.654 pg/mL)的GrB分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.01)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128、CMV肽pp65495-503的DC或未负载抗原肽的DC混合培养4 h,TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原肽DC的杀伤活性。结果显示,负载MTB肽组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和负载HIV-1肽组(Vector plus TCR+DC-HIV组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1708.411, P=0.000; F=114.198,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(31.107±1.140%)和Vector plus TCR+DC-HIV组(21.280±2.862%)的杀伤水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。5)TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-y分泌的剂量效应按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载不同浓度的MTB肽Ag85B 199-207或HIV--1肽Env120-128的DC共培养18 h, ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,TCR载体转染组的IFN-γ分泌水平在MTB肽或HIV-1肽浓度为0.01 μg/mL时即可检测得到,并且随MTB肽或HIV-1肽浓度的增加而升高,呈现出明显的剂量效应；而未转染组和空载体转染组在每一个肽浓度均没有检测到显著的IFN-γ分泌。6)ICS检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ分泌将TCR基因修饰CD8+T细胞与负载MTB肽Ag85B199-207、HIV-1肽Env120-128或CMV肽pp65495-503的DC共培养,利用ICS检测CD8+T细胞的胞内IFN-γ分泌。结果显示,在TCR载体转染组中,通过DC递呈MTB肽Ag85B199-207后,超过5%的TCR基因修饰CD8+T细胞为CD8和IFN-γ双阳性；通过DC递呈HIV-1肽Env120-128后,超过2%的TCR基因修饰CD8+T细胞共表达CD8和IFN-γ;通过DC递呈无关肽CMV pp65495-503后,只有很低水平的双阳性CD8+T细胞可检测到；而在未转染组和空载体转染组中,双阳性CD8+T细胞的水平均很低。5.TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的活性检测1)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的IFN-γ分泌按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养18 h,ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的IFN-γ分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1545.061,P=0.000; F=1611.016, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(338.280 ± 13.919 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(236.875 ± 7.979 pg/mL)的IFN-γ分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。2)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的TNF-a分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中TNF-a的分泌水平。结果显示,转染pViJ.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的TNF-α分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=1648.189,P=0.000; F=341.302, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(307.088 ± 6.695 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(187.847±11.278 pg/mL)的TNF-α分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。3)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的GrB分泌按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养24 h, ELISA检测细胞培养上清中GrB的分泌水平。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的GrB分泌水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=99.449,P=0.000；F=149.589,P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组(289.289 ± 53.946 pg/mL)和Vector plus TCR+DC-Env组(263.086 ± 39.756 pg/mL)的GrB分泌水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.05)。4)TCR基因修饰CD8+T细胞针对内源性抗原的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒、pCAGGS-Env质粒或pCI-OVA质粒的DC共培养4h, TRFIA检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载抗原的DC的杀伤活性。结果显示,转染pV1J.ns-tPA-Ag85B质粒组(Vector plus TCR+DC-MTB组)和转染pCAGGS-Env质粒组(Vector plus TCR+DC-Env组)的杀伤水平组间差异均具有统计学意义(F值和P值分别为F=803.014, P=0.000; F=235.995, P=0.000)。各组间两两比较结果显示,Vector plus TCR+DC-MTB组 (25.663 ± 0.655%)和Vector plus TCR+DC-Env组(15.054±0.696%)的杀伤水平分别显著高于各自的四个对照组(P值均<0.001)。6.TCR基因修饰J.RT3-T3.5细胞的CD69表达水平测定按不同MOI值,将重组逆转录病毒颗粒感染J.RT3-T3.5细胞,流式细胞术结果显示,MOI=5时,J.RT3-T3.5细胞的GFP阳性率最高,在感染后第3天达52.7%。将TCR基因修饰的J.RT3-T3.5细胞与负载不同浓度的MTB肽Ag85B199-207或HIV-1肽Env120-128的T2细胞共培养,流式细胞术检测J.RT3-T3.5细胞CD69的表达。结果显示,通过对GFP阳性的细胞群进行分析,在TCR载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对MTB肽和HIV-1肽均有反应,其早期活化标志CD69的表达在肽浓度为0.01 μg/mL时即有明显升高,且随着肽浓度的增加而增加,表现出明显的剂量效应；但在空载体转染组中,J.RT3-T3.5细胞对每一个浓度的MTB肽和HIV-1肽均没有明显反应,其CD69表达均没有明显升高。结论本研究利用分别负载MTB肽Ag85B199-207和HIV-1肽Env120-128的DC反复刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T细胞,通过CDR3谱型分析,获得针对这两种抗原肽共同特异的单个TCR。通过逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP介导,将该双特异TCR转导至初始CD8+T细胞,人为赋予其识别特异性抗原的能力。由于外源性TCRα、β链可能与内源性TCRα、β链发生错配,因此,为了减少错配机率,同时增加外源性TCR的表达和功能,我们对双特异TCR进行最小突变,即将人C区9个关键位点氨基酸替换为鼠C区相应位点氨基酸。我们将最小突变的双特异TCR基因转导自体CD8+T细胞并检测其活性,结果表明该TCR基因修饰的CD8+T细胞具有双特异性,既可针对MTB肽Ag85B199-207产生高水平的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌及杀伤活性,又可针对HIV-1肽Env120-128产生显著的效应反应。本研究首次提出通过转导一个TCR同时产生针对两种不相似病原体抗原肽的活性反应,为MTB/HIV共感染过继细胞免疫治疗提供了新的思路,同时也为其他共感染疾病的免疫治疗研究提供了模式和平台。