1、背景与目的结核病存在了几千年依然是全球主要的健康问题,痰涂片阳性的肺结核患者死亡率达到了70%,结核病是由结核分支杆菌感染并引起以青年人为主要感染人群的一种慢性传染性疾病,它严重影响着人类的健康。然而这一情况并没有随着时间的进展而得到控制。总的来说,占全球总人数大约5%-15%的人口(估计20-30亿)一生中感染了结核分枝杆菌最终将导致结核病。然而,在发展中国家结核病的发病概率已结高于艾滋病毒感染的概率,并且其致死率也高于艾滋病毒的致死的传染性疾病死亡人数,是传染性疾病致死的主要原因。结核病的发病受多种因素的影响,其中宿主遗传基因在其中起着重要的角色。在发展中国家,脊柱结核是最常见的肺外结核,脊柱结核破坏患者的椎体与椎间盘并形成流注脓肿,常并发脊柱畸形、截瘫,严重者甚至导致死亡。在脊柱结核的病理过程中,椎间盘破坏是脊柱结核疾病的一个特征性改变,但是其发生机制并不明确。近年来研究发现多种细胞因子在结核病的病理过程中起到的作用越来越重要,已有研究表明MIF、TGF-β1、IFN-γ等细胞因子在结核免疫中起重要作用,但是上述三种细胞因子在脊柱结核患者的椎间盘破坏中是否起作用需要更深入的研究。MIF可以在体外杀灭结核分支杆菌,在机体的结核免疫中可以抑制巨噬细胞随机游走聚集到结核分支杆菌侵入部位并释放各种细胞因子并加剧炎症反应,促进基质金属蛋白酶、NO、及IFN-γ的释放,而基质金属蛋白酶又促进并加剧了椎间盘破坏的发生,因此MIF同时具有抗结核免疫及促炎作用。TGF-β1可以抑制IFN-γ与TNF-α的活性,同时上调MMP-2与MMP-9的表达,抑制T淋巴细胞的功能最终降低对人体对结核分支杆菌的抵抗力并加重椎间盘的破坏。IFN-γ可以通过活化的T淋巴细胞及效应细胞杀灭结核分支杆菌并发挥抗结核免疫功能。目前关于MIF、TGF-β1与IFN-γ在脊柱结核病理机制中的研究较少见,其基因多态性与宿主遗传易感性的研究也少见,尤其是关于上述细胞因子在脊柱结合患者椎间盘破坏中的病理机制更少见,基于上述细胞因子在结核免疫中的作用,因此我们选择了上述三种细胞因子进行研究,该研究将有助于加深我们对脊柱结核患者的遗传易感性及椎间盘的破坏机制的了解。2、方法2.1正常对照组:2014年9月至2015年9月广西医科大学附属医院体检中心血液检查确诊的正常广西汉族人110例。正常入组者纳入标准包括:1.纳入者不能具有免疫学疾病:如风湿、类风湿、干燥综合征、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等。2.除外肿瘤患者。3.除外HIV阳性患者。4.除外结核病患者。脊柱骨折组:2014年9月至2016年6月广西医科大学附属医院脊柱外科诊断为脊柱骨折,需行椎间盘切除手术者,共10例(患者均为为正常广西汉族人)。正常入组患者还需要满足以下几点要求:1.患者不能具有免疫学疾病:如风湿、类风湿、干燥综合征、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等。2.除外肿瘤患者。3.除外HIV阳性患者。4.组织病理学检查与影像学诊断均符合正常的椎间盘组织。脊柱结核组:选取2014年9月至2016年6月在广西医科大学附属医院脊柱骨病外科因确诊为脊柱结核并有手术指征行病灶清除、减压、植骨等手术者,共110例(患者均为广西汉族人)。脊柱结核患者入组标准为同时具有以下几点:1.具有典型结核症状,午后低热、盗汗、乏力、消瘦等症状者。2.具有神经压迫症状者。3.患者血液检查诊断符合结核诊断者。4.术后组织病理学检查确诊为脊柱结核者。5.影像学检查与结核菌素试验符合结核诊断者。6.排除其他免疫性疾病、肿瘤及HIV感染者等。7.排除肺结核患者。2.2采用血液基因组DNA提取技术及椎间盘组织RNA提取技术及蛋白提取技术、普通PCR技术、逆转录技术、基因测序技术和荧光定量PCR技术及蛋白质印迹法技术,研究分析MIF、TGF-β1、IFN-γ的基因型与脊柱结核遗传易感性的关系,MIF、TGF-β1、IFN-γ在正常的椎间盘与结核性椎间盘中的表达水平及MIF、TGF-β1、IFN-γ的m RNA转录水平在正常的椎间盘组织与结核性椎间盘组织中的表达情况及差异性。3、结果3.1研究结果显示在广西汉族人群中MIF rs755622多态位点(CC+GC)基因型与C等位基因、TGF-β1rs4803455位点CC基因型与C等位基因明显高于健康对照组(P<0.05)。研究结果显示MIF、TGF-β1和IFN-γ在脊柱结核患者椎间盘中的含量明显高于脊柱骨折组(P<0.05)。研究结果显示脊柱结核组中TGF-β1和IFN-γ在椎间盘中的m RNA表达明显高于脊柱骨折组椎间盘的表达(P<0.05),而脊柱结核组中MIF的m RNA表达水平明显低于脊柱骨折组(P<0.05)。3.2研究结果显示在脊柱结核患者椎间盘中TGF-β1与IFN-γ的m RNA表达水平呈负相关。脊柱结核患者的MIF的m RNA表达与临床资料无关,脊柱结核患者TGF-β1和IFN-γ的m RNA转录水平表达与患者的病灶的节段、性别等无关。吸烟习惯与TGF-β1的m RNA表达水平呈正相关(p=0.026)。VAS评分能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(P=0.026、P=0.019),TGF-β1的m RNA表达水平在VAS评分为8-10分时的重度疼痛时明显高于在VAS评分在0-4分的轻度疼痛,IFN-γ的m RNA表达水平在VAS评分为0-4分时的轻度疼痛时明显高于在VAS评分在8-10分的重度疼痛。病程长短能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(P=0.009,P=0.022),TGF-β1的m RNA表达水平在病程在3-12月时明显高于病程小于3个月的患者,IFN-γ的m RNA的表达水平在病程小于3月的患者明显高于病程在3-12月的患者。血清CRP与ESR的水平能够影响TGF-β1和IFN-γ的m RNA的表达水平(CRP:P=0.004,P=0.011,ESR:P=0.007,P=0.026),CRP>30 mg/L时,TGF-β1的m RNA表达水平高,CRP<10 mg/L时,IFN-γ的m RNA的表达水平高,ESRs>40 mm/h时,TGF-β1的m RNA表达水平高,ESRs<20 mm/h时,IFN-γ的m RNA的表达水平高。脊柱结核组中患者的炎症反应指标越高TGF-β1的m RNA表达越高,IFN-γ的m RNA表达越低(P<0.05)。4、结论4.1在本实验中发现广西地区汉族人群中MIF rs755622与TGF-β1rs4803455位点与脊柱结核病的易感性相关,推测等位基因C可能是增加脊柱结核病易感性的因素之一。4.2在本实验中发现脊柱结核患者椎间盘组织中均有MIF、TGF-β1和IFN-γ的蛋白质水平与m RNA水平均有表达。MIF、TGF-β1和IFN-γ脊柱结核患者椎间盘中蛋白含量高于对照组,因此我们推测在脊柱结核的炎症免疫反应过程是多种不同的细胞因子共同作用结果,MIF、TGF-β1可能参与了脊柱结核的免疫过程并介导了椎间盘破坏的病理过程,IFN-γ可能参与了脊柱结核的免疫过程并起到重要的保护作用。4.3在本实验中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与脊柱结核患者的吸烟的量有关,推测吸烟可能是影响脊柱结核预后的不良因素。在本研究中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中IFN-γ的m RNA表达水平与VAS评分负相关,TGF-β1的m RNA表达水平与VAS评分呈正相关。推测TGF-β1可能通过调节炎症反应程度引起疼痛加重。在本实验中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与病程长短呈正相关,IFN-γ的m RNA表达水平与病程长短负相关。推测病程长短与脊柱结核患者的预后密切相关。在本研究中证实了脊柱结核患者椎间盘组织中TGF-β1的m RNA表达水平与血沉及C反应蛋白水平呈正相关,IFN-γ的m RNA表达水平与血沉及C反应蛋白水平负相关。推测其在脊柱结核炎症反应中发挥不同作用,并且不同炎症阶段的TGF-β1与IFN-γ的作用及表达量也各不相同。