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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以严重的肠炎、呕吐和水样腹泻为主要特征的猪的一种急性高度接触性肠道传染病。该病的流行给养猪业带来了巨大的经济损失。然而,对于PEDV的致病机制的研究还不是很清楚。其核衣壳蛋白(N protein)由441个氨基酸组成,分子量为55-58kDa,表现为高的碱性,高的丝氨酸含量,为一种多功能的磷酸化蛋白,其与病毒基因组RNA相互作用形成病毒核糖核衣壳结构。核衣壳蛋白是在冠状病毒感染细胞中产生量最多的病毒蛋白之一。研究表明其在诱导免疫和病毒感染的致病机制中起着重要的作用。因此,本研究开展了N蛋白在感染细胞中定位的研究,这将为PEDV致病机理的阐明提供可靠的依据。本研究首先对N蛋白进行了生物信息学分析,结果显示N蛋白表现高的等电点,存在一个可预测的核定位信号(NLS)和一个可能潜在的核(或核仁)定位信号((N(或No)LS),都是碱性氨基酸富集区,而且这些信号位于亲水性区域中,是易于接近的。本研究将PEDV CV777 N基因编码区克隆到原核表达载体pET30a(+),经IPTG诱导,6His标签的N蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,将表达产物纯化,免疫雌性的BaLB/c小鼠制备了PEDV CV777 N蛋白的抗血清;为了分析N蛋白在感染细胞内的定位特征,以MOI=1的PEDV CV777感染Vero E6细胞,而后借助间接免疫荧光试验和激光共聚焦显微镜技术检测N蛋白在细胞内的分布,结果表明,大部分细胞中N蛋白只在细胞质中分布,只有少数细胞中N蛋白分布到细胞质和细胞核中。利用构建的N基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-N瞬时转染Vero E6细胞,借助激光共聚焦显微镜来分析N蛋白单独表达后在细胞内的定位情况,并借助流式细胞仪分析N蛋白的表达后Vero E6细胞周期变化;分析结果显示出与病毒感染相似的定位特征,大部分细胞中N蛋白只定位到细胞的细胞质中,只有少数细胞中N蛋白展示出在细胞质和细胞核中的定位,并且N蛋白的表达延长了Vero E6细胞的G2/M期。结果表明病毒可能通过N蛋白的表达抑制细胞RNA和蛋白质在G2/M期的合成,来促进病毒的繁殖。通过N蛋白氨基酸序列的比较,冠状病毒可分为三个保守性的区域。根据这个特点,将PEDV N基因进行不同区域截短和预测定位信号融合绿色荧光蛋白的真核表达构建,但是不破坏预测的定位信号的完整性,同时构建了标记细胞核核仁成分B23.1的融合红色荧光蛋白的真核表达质粒pDsRed-B23.1,进行共转染Vero E6细胞,利用共聚焦显微镜观察活细胞中截短片段和预测定位信号融合表达蛋白在细胞核或核仁的分布情况,并分析与细胞核仁成分的共定位特征。结果表明空载体蛋白AcGFP1和DsRed在细胞质和细胞核中均匀分布;AcGFP-N主要在细胞质和细胞核的核仁结构中分布,并且与细胞核磷蛋白B23.1发生共定位; AcGFP-NRⅠ主要定位到细胞的核仁结构中;AcGFP-NRⅡ主要定位到细胞核和核仁中,而且在核仁中的蛋白分布大于细胞核中的蛋白分布;AcGFP-NRⅢ定位到细胞质和细胞核中,没有观察到核仁定位;单独表达的AcGFP-pat7主要定位到细胞核中;单独表达的AcGFP-patx表现出很强的细胞核和核仁的定位;NRⅡ蛋白中pat7的缺失和N蛋白中patx的缺失没有改变NRⅡ和N蛋白核仁的定位,表明这些信号不是N蛋白细胞核仁定位中起主导作用的定位信号;而结果也揭示了NRⅠ蛋白和NRⅡ蛋白中一定存在用生物信息学不可预测到的核仁定位信号来引导N蛋白的核仁定位,为进一步功能性起作用核仁定位信号的鉴定提供可靠依据。将B23.1基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中进行表达,SDS-PAGE结果表明,目的蛋白成功表达,并纯化出GST-B23.1蛋白。Western blot分析结果表明目的蛋白具有很好的反应活性,为后续的N蛋白与B23.1蛋白相互作用的分析奠定了基础。