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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是全世界心脏死亡的常见原因。一般认为AS是脂质沉积在动脉,并伴随着血管弹性的丧失,导致通过血管的血流量减少。不稳定的AS斑块会破裂,导致血栓形成和血流中断,危及患者生命。目前临床常用的他汀类药物副作用较大,因此寻求新的治疗药物并筛选新的药物干预靶点,对防治AS的发生尤为重要。淫羊藿苷（Icariin,ICA）是传统补益中药淫羊藿（Epimedium）的主要活性成分之一,具有增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢、补肾壮阳、抗衰老等药理作用。本课题组多年来一直进行ICA对心血管系统保护作用的研究,在体内实验证实ICA可抑制高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠AS的进展,并利用芯片技术构建基因表达谱。但ICA的具体作用机制尚未进行深入探索,且对于ICA干预疾病发生发展过程中长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和微小RNA（micro RNA,miRNA）的作用知之甚少。基于课题组前期研究,发现lncRNA H19在ICA抑制平滑肌细胞增殖和迁移中发挥重要作用,而lncRNA H19对内皮细胞的影响尚不清楚,故本研究选择lncRNA H19作为研究对象,探讨ICA通过lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5通路发挥其改善AS的作用,并在体内、外加以验证,以期为开发和利用以ICA为药效成分的中药资源提供科学依据。研究分为3部分:（1）ICA治疗ApoE-/-小鼠AS基因芯片的生物信息学分析与lncRNAH19/miR-148b-3p/ELF5信号通路的构建和验证本课题组前期研究证实ICA可抑制ApoE-/-小鼠体内的AS进展,ICA的干预作用可能与小鼠主动脉中lncRNA H19的显著上调密切相关。体外实验也证实lncRNA H19介导了ICA抑制平滑肌细胞增殖和迁移的作用,但lncRNA H19对内皮细胞功能的影响尚不清楚,因此,本研究确定lncRNA H19作为研究对象。随后对课题组前期构建的ICA治疗ApoE-/-小鼠AS的miRNA芯片进行生物信息学分析,筛选出符合条件的miRNAs,最终确定与lncRNA H19存在结合位点且与心血管疾病进程相关的miR-148b-3p作为下一步研究对象。对miR-148b-3p的靶基因进行KEGG信号通路富集分析,发现ETS家族的靶基因较多且p值较小。进一步对ETS家族富集得到的靶基因进行结合位点预测,发现ELF5 m RNA的3’-UTR处与miR-148b-3p存在结合位点且靶向性良好。另外,查阅文献可知ELF5与细胞的增殖、分化及细胞与细胞间的相互作用和血管生成有关。由此构建出lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5通路,并推测ICA可能通过lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5通路发挥其改善AS的作用。随后对预测得到的lncRNA H19、miR-148b-3p及其靶基因ELF5在课题组前期实验提供的ApoE-/-小鼠主动脉中进行初步验证,发现ApoE-/-小鼠主动脉组织中lncRNA H19和ELF5 m RNA及蛋白表达降低,miR-148b-3p表达升高,ICA可逆转上述改变。说明ICA对AS的保护作用可能是通过lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5通路实现的。采用双荧光素酶报告基因实验证实,lncRNA H19可靶向调控miR-148b-3p;miR-148b-3p可靶向调控ELF5。（2）ICA通过lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5通路抑制人脐静脉内皮细胞内皮间质转化用氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,发现ox-LDL能降低HUVECs中lncRNA H19和ELF5 m RNA及蛋白表达,升高miR-148b-3p表达,ICA能逆转上述改变。通过划痕、Transwell及Western blot实验方法,发现ICA能抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞迁移能力增强,升高内皮标志物表达,降低间质标志物表达,抑制ox-LDL诱导的内皮间质转化（Endothelial-mesenchymal transition,End MT）。在HUVECs中转染lncRNA H19过表达/沉默慢病毒构建稳定转染细胞株,发现过表达lncRNA H19能抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞End MT,沉默lncRNA H19则促进End MT。为进一步研究ICA是否通过lncRNA H19发挥抑制End MT的作用,在HUVECs给予ICA干预的同时转染lncRNA H19沉默慢病毒,发现沉默lncRNA H19可部分阻断ICA抑制End MT的作用,说明lncRNA H19介导了ICA抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞End MT。随后检测了lncRNA H19对其下游miRNA及靶基因的影响,发现过表达lncRNA H19可下调miR-148b-3p表达,上调ELF5m RNA及蛋白表达;沉默lncRNA H19可上调miR-148b-3p表达,下调ELF5m RNA及蛋白表达,并且miR-148b-3p mimics部分阻断了lncRNA H19对ELF5表达的上调作用。证明lncRNA H19与miR-148b-3p、miR-148b-3p与ELF5在HUVECs中存在靶向调控关系,与双荧光素酶基因报告实验结果一致。为进一步证实lncRNA H19是通过miR-148b-3p/ELF5发挥抑制End MT作用,本研究通过挽救实验发现过表达lncRNA H19可抑制HUVECs细胞End MT;而miR-148b-3p mimics或si-ELF5可促进HUVECs细胞End MT;当在HUVECs中同时转染lncRNA H19过表达慢病毒和miR-148b-3p mimics或si-ELF5时,miR-148b-3p mimics或si-ELF5部分阻断了lncRNA H19对细胞End MT的影响,说明lncRNA H19通过miR-148b-3p/ELF5发挥抑制End MT的作用。（3）LncRNA H19在ICA改善ApoE-/-小鼠AS中的作用选择ApoE-/-小鼠作为研究对象,灌胃给予ICA后,可明显改善ApoE-/-小鼠血清血脂水平,减少主动脉油红O染色面积,降低血管内膜增厚程度。说明ICA能够改善ApoE-/-小鼠血脂水平、动脉脂质沉积和血管病理改变。在对ApoE-/-小鼠灌胃给予ICA干预的同时,尾静脉注射lncRNA H19沉默慢病毒后,小鼠血清血脂异常、主动脉油红O染色面积和血管内膜增厚程度较高脂饮食组（HFD组）无明显改善。说明lncRNA H19部分阻断了ICA改善血脂水平、动脉脂质沉积和血管病理改变的作用。为进一步探究lncRNA H19在ICA改善ApoE-/-小鼠主动脉End MT中的作用,利用RT-qPCR、Western blot及免疫荧光技术检测了小鼠主动脉中lncRNA H19、miR-148b-3p、ELF5和End MT相关蛋白（CD31、VE-Cadherin、α-SMA及S100A4）的表达。ICA可以升高ApoE-/-小鼠主动脉组织中lncRNA H19和ELF5m RNA及蛋白表达,降低miR-148b-3p表达,升高内皮标志物CD31和VE-Cadherin蛋白表达,降低间质标志物α-SMA和S100A4蛋白表达。说明ICA能够调节ApoE-/-小鼠主动脉中lncRNA H19、miR-148b-3p、ELF5的表达并抑制主动脉End MT。在对ApoE-/-小鼠灌胃给予ICA干预的同时,尾静脉注射lncRNA H19沉默慢病毒后,主动脉组织中lncRNA H19、miR-148b-3p和ELF5 m RNA及蛋白表达,内皮标志物和间质标志物表达较HFD组无明显改善。说明lncRNA H19部分阻断了ICA调节lncRNA H19、miR-148b-3p、ELF5的表达并抑制主动脉End MT的作用。综上所述,本研究通过体内外实验得到以下结论:1.通过对课题组前期研究得到的ICA治疗ApoE-/-小鼠AS的基因芯片进行生物信息学分析,选择lncRNA H19作为研究对象,对其进行靶基因预测,构建出lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5信号通路。2.体外研究证实,ICA抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞End MT,其作用可能是通过lncRNA H19/miR-148b-3p/ELF5信号通路实现的。3.体内研究证实,ICA对ApoE-/-小鼠AS的保护作用可能是通过lncRNA H19实现的,说明lncRNA H19可能是ICA抑制AS的重要分子靶点。