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鸡白痢沙门菌是当前危害我国养禽业的重要病原菌,每年均造成了较为严重的经济损失。《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》明确要求实施鸡白痢净化工程,养殖企业主要采取血清学诊断方法进行鸡白痢的检疫,淘汰阳性鸡达到净化鸡群的目的。疫苗可作为净化的辅助手段,其中减毒活疫苗与灭活疫苗和亚单位疫苗相比,不仅具有持久刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答的特点,还可以通过基因缺失策略设计为区分自然感染与疫苗免疫动物的DIVA疫苗,这对种群中鸡白痢的净化具有重要意义,显示出广阔的应用前景。我们在前期研究构建的鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株S004AaroA基础上,运用λ-Red同源重组的方法进一步成功构建了鸡白痢沙门菌spB、crp和rfaG基因的多基因缺失株,并通过对其生物学特性、致病性和免疫效力进行评价,筛选出较理想的减毒疫苗候选株,为进一步研发鸡白痢沙门菌减毒疫苗奠定基础。1.鸡白痢沙门茵spB、crp和rfaG基因缺失株的构建及生物学特性的测定选择与鸡白痢沙门菌侵袭力和耐高渗能力相关的基因sipB、与菌毛表达相关的基因crp和与脂多糖合成相关的基因rfaG设计引物,以S004AaroA为母本株,利用λ-Red同源重组系统构建了 4株双基因或三基因缺失株,分别命名为S004 AaroA△sipB、S004 △aroA △crp、S004AaroA△sipB△rfaG 和S004△aroA△crp△rfaG。并对各基因缺失株进行生长曲线测定和细胞黏附与入侵试验。结果显示,S004△aroA△sipB和S004△aroA△sipBΔrfaG的生长速度与野生株相比无显著差异(P>0.05),S004AaroA△crp 和 S00A△aroA△crp△rfaG 在普通肉汤培养基中生长受限,当添加0.05%葡萄糖后可恢复与野生株相近的生长速度。遗传稳定性试验显示,所有基因缺失株在传代50代后性状均未发生改变,各个基因遗传稳定,未发生回复或突变。对HeLa细胞的黏附与入侵试验结果显示,sipB基因缺失能显著降低细菌的黏附与入侵能力。本研究为鸡白痢减毒疫苗候选株的进一步筛选奠定了基础。2.鸡白痢沙门菌基因缺失株的致病性及免疫效力评价2日龄SPF雏鸡腹腔注射攻毒,测定半数致死量(LD50)评价各缺失株的致病性。结果显示,野生株S004的LD50为6.O×1O7CFU,单基因缺失株S004△aroA的 LD50 为>1.3×109CFU,双基因缺失株 S004△aroA△sipB 和 S004△aroA△crp的LD50分别为>1.A×109CFU和>1.7×109 CFU,三基因缺失株S004△aroAAsiprfaG和S004△aroA△crp△rfaG的LD50 分别为>2.1×109 CFU和 1.4×109CFU,S004△aroA△sipB和S004△aroA△sipB△rffaG 的毒力较母本株S004△△aroA进一步致弱。每种基因缺失株以108 CFU剂量口服免疫2日龄SPF雏鸡,免疫后14 d以109 CFU剂量腹腔注射野生型S004菌株进行人工攻毒,通过对攻毒前后的鸡只体重进行监测,结果显示,S004△aroA、S004△aaroA△sipB和S004△△aro△sipB△rfaG免疫组的体重增长情况在免疫期内与健康对照组相比差异不显著(P>0.05);免疫保护力的测定结果显示,S004△aroA△sipB和S004△aroA△sipB△rfaG组的免疫保护效果最好,提供了 83.3%的保护力,优于单基因缺失株S004△aroA(66.7%)和肠炎沙门菌疫苗对照株Sm24(50%),而S004△aroAAcrp(16.7%)和 S004△aroA△crp△rfaG(33.3%)的免疫保护效果不理想。综上所述,S004△aroA△sipB和S004△aroA△sipB△rfaG均提供了较好的免疫保护效果,其中S004△aroA△sipB△rfaG由于缺失rfaG基因具有DIVA特性,可用于区分自然感染和免疫感染家禽,因此S004△aroA△sipB△rfaG可以作为鸡白痢沙门菌DIVA减毒疫苗的候选株。