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【研究背景】近年来,肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗领域取得了重大进展。免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor,ICIs）,如程序性死亡因子-1受体（Programmed death-1,PD-1）及其配体（Programmed death ligand,PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）等相关抗体治疗肝癌的临床研究,中位无进展生存期（Progression-Free Survival,PFS）最长达到了9.7个月,但仍难以持久地抑制肝癌的生长。对于ICIs而言,肿瘤内浸润的淋巴细胞数量是ICIs取得良好效果的基本条件,免疫检查点相关阻断治疗最终依赖T细胞发挥作用,但是无论是肿瘤自身诱导的T细胞还是过继输入的活化T细胞或者靶向实体肿瘤的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T）,其与肿瘤细胞接触后在肿瘤内环境中的演变并不清楚。PD-1是一种I型跨膜蛋白,在活化的T细胞,B细胞和NK细胞等免疫细胞中表达。PD-L1是B7家族的成员,该家族的共刺激或共抑制分子在包括癌细胞在内的多种细胞上表达。当PD-1与PD-L1结合时,PD-1通过几种尚不明确的分子机制强烈干扰T细胞受体（T cell receptor,TCR）信号转导,对T细胞的功能和增殖起到抑制作用。常规T细胞过继免疫治疗和靶向实体肿瘤的CAR-T细胞治疗,T细胞几乎都在肿瘤组织的外缘,在肿瘤的微环境中,免疫抑制微环境抑制了T细胞向肿瘤内部的趋化,这其中,PD-1/PD-L1是如何调节T细胞的浸润和功能并不清楚。在T细胞向肿瘤趋化的过程中,趋化因子受体3（Chemokine receptor 3,CXCR 3）是T细胞向肿瘤组织趋化的重要因子,而炎性小体Nod样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP 3）又是CXCR 3在T细胞上表达的关键调节蛋白,无论是NLRP 3的活化还是CXCR 3的表达都与磷脂肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号途径密切相关。MAPK目前发现有12种分为3类家族,细胞外信号调节激酶1/2（Ex-ternal-signalregulatedkinase1/2,ERK 1/2）是其家族之一。已有研究证明PD-1和PD-L1结合可以抑制T细胞的PI3K/AKT和ERK磷酸化。PD-1/PD-L1是否会通过抑制PI3K和/或MAPK通路影响NLRP 3活化继而影响CXCR 3表达,最终调节T细胞向肿瘤内的浸润?对这些问题的研究,有助于了解过继输入的活化T细胞和CAR-T细胞在肿瘤微环境中的迁移特性,为肿瘤免疫治疗提供有益的支持。【研究目的】阐明PD-1/PD-L1是否会通过PI3K或MAPK通路影响NLRP 3活化继而影响CXCR 3表达,最终调节T细胞向肿瘤内的浸润,为肝细胞癌免疫治疗寻找更有效的方法。【研究方法】本研究应用CRISPR/Cas 9技术敲除活化T细胞和嵌合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3,GPC 3）的T细胞（CAR-GPC 3-T）的PD-1,建立敲除PD-1的多种细胞因子诱导的活化T细胞和CAR-T细胞体外培养体系,再与MHCC 97,Hep G 2,SMMC-7721,Huh-7等不同遗传背景的肝癌细胞共培养。采用流式细胞术检测PD-1敲除效率、T细胞表型变化和PD-1、CXCR 3表达率以及肿瘤细胞PD-L1表达变化情况,探究活化T细胞和人肝癌细胞株共培养时对彼此PD-1和PD-L1表达的影响,以及体外培养时不同细胞因子对T细胞表面CXCR 3的表达的影响。采用ELISA法检测各组活化T细胞IFN-γ分泌水平,CCK-8法测定增殖率和各组对肝癌细胞的杀伤率,Transwelll法观察各组细胞迁徙和侵袭能力变化。采用蛋白印迹法检测T细胞的PD-1与PD-L1结合后是否通过影响T细胞AKT磷酸化直接抑制T细胞趋化,同时通过抑制T细胞NLRP 3表达和ERK磷酸化影响其表面CXCR 3的表达。建立Huh-7裸鼠肝脏原位癌模型,尾静脉注射各组活化T细胞。89Zr标记T细胞,行小动物PET-CT扫描,观察活化T细胞在活体内的分布。采用苏木素-伊红（H＆E）染色观察肝细胞癌组织病理学变化,免疫组化和免疫荧光法（IF）分析活化T细胞对原位肝癌的趋化能力和分布情况及其与PD-1和PD-L1表达的相关性。本研究从体外细胞实验和体内模型两方面阐明PD-1调控T细胞浸润杀伤肝细胞癌的机制。【研究结果】1、体外细胞实验1.1不同遗传背景的肝癌细胞株与活化T细胞共培养后相互影响PD-L1和PD-1的表达不同遗传背景的肝癌细胞株均表达PD-L1,与活化T细胞共培养时,除了表达HBs Ag的MHCC 97细胞株以外,其他肝癌细胞株的PD-L1均有明显升高,其中低分化的SMMC7721细胞株的PD-L1表达升高最显著,提示在与T细胞的相互作用中,不同遗传背景的肝癌细胞株PD-L1的上调程度不同,这可能是临床应用ICIs治疗肝癌存在个体差异的原因之一。1.2活化T细胞在与肝癌细胞接触后,可被诱导表达PD-1与肝癌细胞株共培养24 h后,未敲除PD-1基因的各组活化T细胞的PD-1表达率均升高,电转染法导入PD-1-sg RNA-Cas 9复合物可以显著抑制活化T细胞的PD-1的表达。1.3敲除或阻断活化T细胞的PD-1可增强其对肝癌细胞的体外杀伤效应与肝癌细胞共培养24 h,敲除PD-1的活化T细胞对肝癌细胞杀伤率高于阻断组和对照组;共培养72 h,阻断组和敲除组的杀伤效率相似,均高于对照组;敲除或阻断PD-1受体的活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率与肝癌细胞株PD-L1的表达显著正相关;正常活化T细胞对肝癌细胞的杀伤率与肝癌细胞株PD-L1的表达呈显著负相关。在与各肝癌细胞共培养后,各组活化T细胞均可观察到IFN-γ分泌水平上升,但敲除PD-1的活化T细胞在刺激24 h后即可检测到IFN-γ明显上升,而应用PD-1单克隆抗体阻断的活化T细胞在72 h后才观察到IFN-γ明显上升。表明,敲除活化T细胞PD-1与单克隆抗体阻断相比,杀伤效应更具时效性1.4 T细胞表达PD-1与肝癌细胞PD-L1结合影响了CXCR 3表达研究发现,与T细胞共培养时,肝癌细胞株PD-L1的表达水平不同,而T细胞表面CXCR 3的表达与肿瘤细胞株PD-L1的表达呈负相关,提示PD-L1与PD-1结合直接影响了T细胞CXCR 3的表达。1.5 PD-1抑制高表达CXCR 3的T细胞趋化、迁徙应用CD 3/CD 28、IL-2和GM-CSF组合在体外成功培养出高表达CXCR3的活化T细胞和CAR-T细胞。Transwell实验发现,高表达CXCR3的活化T细胞和CAR-T细胞相比其他因子处理的T细胞可以更多的迁移到添加了CXCL9的Treaswell下室,提前添加PD-L1可以阻止T细胞迁徙。1.6 PD-1调控T细胞浸润杀伤肝细胞癌通过PI3K/AKT-NLRP 3和ERK 1/2信号通路（1）PD-1与PD-L1结合抑制CXCL 9/CXCR 3诱导的AKT磷酸化已知CXCL 9与CXCR 3结合后可激活下游的AKT,诱导肌动蛋白重组、T细胞趋化。结果发现,PD-L1可以阻断由CXCR 3配体激活的AKT磷酸化,AKT磷酸化是T细胞趋化的必要条件,提示PD-1与PD-L1结合可能通过抑制AKT磷酸化抑制T细胞趋化。（2）CXCR 3表达是PI3K/AKT-NLRP 3和ERK 1/2信号通路依赖性在体外的T细胞培养体系中,通过提前30min加格列本脲（阻断NLRP 3）或p38 MAPK抑制剂、ERK 1/2抑制剂,再加GM-CSF 1000U/ml刺激36 h。发现对照组的CXCR 3表达率85.32±5.63%,p38阻断组的CXCR 3表达率83.67±3.19%,ERK阻断组的CXCR 3表达率63.21±3.34%,加格列本脲组CXCR 3表达率15.14±3.35%。结果提示T细胞的CXCR 3的表达是PI3K/AKT-NLRP 3和ERK1/2信号通路依赖性的,以PI3K/AKT-NLRP 3通路为主。（3）PD-1与PD-L1结合抑制NLRP 3和ERK磷酸化为明确PD-1与PD-L1结合抑制T细胞CXCR3的表达的机制,我们用终浓度为400mmol/L的Kyn刺激T细胞48 h,此时的T细胞高表达PD-1,达到82.8±20.66%[39],然后用PD-L1（50μg/ml）处理24 h,再用LPS刺激T细胞24 h。结果发现,应用PD-L1处理后,抑制了T细胞NLRP 3的表达,同时也抑制了ERK磷酸化;提前加入PD-1单抗或敲除T细胞的PD-1,用PD-L1处理后,再用LPS刺激,可以观察到NLRP 3高表达和ERK磷酸化,提示敲除PD-1或应用PD-1阻断剂,可以通过增加NLRP 3水平和ERK磷酸化提高CXCR 3的表达。2、体内实验2.1活化T细胞有天然归巢肝脏的特点,但在肝癌内部分布较少利用PET-CT观察过继回输的活化T细胞在原位肝癌裸鼠模型活体内的分布,发现裸鼠尾静脉给予89Zr-标记的活化T细胞后,放射性物质主要分布于肝、脾和肺。其中,肺的放射性物质在4 h内迅速降低,而肝和脾的放射性物质在4 h后迅速升高,并在336 h后仍能维持在高水平,提示活化T细胞有天然的肝脏归巢特性,免疫组化显示原位肝癌内仅有少量T细胞浸润,而且迅速出现PD-1和PD-L1阳性。2.2敲除PD-1可增强高表达CXCR3的T细胞向原位肝癌浸润杀伤效应敲除T细胞的PD-1增加了肝细胞癌血窦周围T细胞数量,浸润在肿瘤内部的T细胞也有增加。这表明敲除PD-1的T细胞向肿瘤内的趋化能力增强。【研究结论】1、肝癌细胞株与活化T细胞共培养可相互影响PD-L1和PD-1的表达,并且与肝癌细胞株遗传背景相关;2、敲除或阻断活化T细胞PD-1可明显增强其对肝癌细胞的体外杀伤效应,该效应与活化T细胞刺激的肝癌细胞PD-L1表达呈正相关;3、敲除T细胞的PD-1,能增加更多的CXCR 3的表达,可以提高T细胞向肝癌内浸润和杀伤能力;4、PD-1和PD-L1结合通过抑制PI3K和ERK通路,降低了T细胞CXCR 3的表达;PD-1可以抑制T细胞AKT磷酸化,阻止由CD 3/CD 28、IL-2和GM-CSF联合刺激的高表达CXCR 3的T细胞趋化、迁徙。