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环磷酸腺苷(cAMP)是生物体内广泛存在的一种生理活性物质,对糖代谢、脂肪代谢以及核酸和蛋白质合成等具有重要的调节作用。该物质在植物生长、临床医药和饲料添加剂等方面应用广泛,发挥着重要的作用。微生物发酵生产法具有清洁高效、环境友好等优点,被认为是最具潜力的cAMP合成方法。微生物发酵过程中,ATP在腺苷酸环化酶的催化下直接环化形成cAMP,ATP含量和再生效率的高低决定着cAMP能否高效合成。本文以节杆菌(Arthrobacter sp.)A.sp01为出发菌株,通过外源添加辅助能量物质的方式,对cAMP合成的代谢途径进行调控,显著提高了产物的产量和得率,在此基础上,研究了柠檬酸钠促进cAMP发酵合成的作用机制,并且提出了两个基于柠檬酸钠添加的cAMP高产发酵工艺,具体的结果如下:(1)研究了柠檬酸钠促进cAMP发酵合成的作用机制。摇瓶实验确定了发酵30 h添加3 g/L-broth柠檬酸钠的最佳条件,该条件下cAMP产量显著提高,比对照提高了54.3%。在7 L发酵罐上,验证了柠檬酸钠的最适添加条件,cAMP产量在50 h达到最大的3.68 g/L,比对照批次提高了11.2%(72 h,3.32 g/L),生产效率提高了60.2%,cAMP发酵性能得到显著提高。关键酶活性、中间代谢物和氨基酸含量分析结果表明,柠檬酸钠显著提高了磷酸戊糖途径、TCA循环以及cAMP合成途径中酶的活性,降低了糖酵解途径的代谢强度;同时胞内氨基酸尤其是Asp、Glu、Gly等前体氨基酸的含量明显上升。这表明柠檬酸钠的添加改变了代谢流的分配,使更多的碳流分配到cAMP合成途径,同时柠檬酸作为底物被吸收进入TCA循环促进了前体氨基酸积累和NADH再生,为产物高效合成提供了物质基础。胞内NADH与ATP含量的测定结果表明,柠檬酸钠作为辅助能量物质促进了NADH再生,为ATP的高效合成提供了能量基础,进而促进了产物的高效发酵生产。(2)通过从头合成途径进行cAMP生产时,适时适量添加前体氨基酸可以有效促进产物合成。在摇瓶条件下,通过单因素和正交试验确定了Asp 0.2 g/L、Gly 1.0 g/L、Glu 4.0 g/L为最优的组合条件。在7 L发酵罐上,考察了最优氨基酸添加条件对cAMP发酵的影响,结果表明,27 h添加氨基酸混合液条件下,发酵进行至60 h产量达到最大,为3.35 g/L,与对照批次相比,发酵周期缩短了12 h,生产效率提高了21.7%。但是,cAMP的产量提高幅度不大,葡萄糖的消耗较大,添加氨基酸的优势未充分体现。提出了基于柠檬酸钠与前体氨基酸偶合添加的cAMP发酵工艺,并在7 L发酵罐上进行了柠檬酸钠与氨基酸不同组合的发酵实验。结果表明,24 h添加柠檬酸钠并脉冲补充氨基酸批次的cAMP产量最高,为4.31 g/L,生产效率达到0.086 g/(L·h),比对照分别提高了29.8%和86.9%。(3)通过摇瓶试验证明次黄嘌呤为激活补救途径的最佳物质,并确定了次黄嘌呤的最适浓度为2 g/L。在7 L发酵罐上进行了添加次黄嘌呤的发酵试验,结果表明添加次黄嘌呤明显提高了cAMP的合成速率,减少了葡萄糖消耗;发酵51 h产量最大,比未添加批次终产量略低,但发酵周期缩短了21 h,生产效率提高了39.1%。为进一步提高cAMP的产量,提出了基于柠檬酸钠与次黄嘌呤偶合添加的cAMP发酵工艺,在7 L发酵罐上进行了24 h添加3 g/L-broth柠檬酸钠与次黄嘌呤脉冲式添加的发酵试验,cAMP产量达到4.42 g/L,发酵强度达到0.088 g/(L·h),比对照分别提高了33.1%和91.3%。