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肿瘤生物标志物的检测在肿瘤诊断和预后过程中起着至关重要的作用。近年来,液体活检作为肿瘤检测的新星被用于肿瘤的早期诊断。该方法只需提取患者体液并分析其中的肿瘤相关的标志物,如游离的肿瘤RNA(ctRNA)、游离的肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTCs)和外泌体(exosomes),即可实现肿瘤的早期诊断。与ctRNA、ctDNA和CTCs相比,外泌体作为一种预后生物标志物具有许多优势。首先,肿瘤相关外泌体在体液中的浓度高于ctRNA、CTCs和ctDNA;其次,肿瘤细胞分泌的外泌体含有多种关键的生物活性分子;第三,这些生物活性分子被外泌体脂质双分子层保护,免受外部蛋白酶和其他酶的降解。但是,由于体积小、生物起源独特、标记物表达的异质性,外泌体分离和检测仍具有挑战性。如:需要昂贵的生物抗体,导致其检测成本较高;缺乏特异性,无法区分肿瘤外泌体与正常外泌体;检测前需要复杂繁琐的分离提取过程;灵敏度低,难以实现低浓度的外泌体检测。因此,需要发展一种灵敏可靠的方法来特异性富集和检测肿瘤源性的外泌体。基于此,本文以特异性检测肿瘤源性外泌体为目标,发展了一种基于Aptamer功能化微珠富集结合杂交链式反应的策略以提高检测特异性与灵敏度。具体的研究内容如下:1.基于PTK7 Aptamer功能化微珠富集和HCR信号放大的白血病细胞外泌体检测以PTK7 Aptamer功能化微珠为捕获单元,富集白血病细胞衍生的囊泡,通过CD63(外泌体标志蛋白)的Aptamer靶向外泌体,结合杂交链式反应(HCR),构建了一种白血病细胞外泌体检测平台。电泳和原子力表征结果表明HCR的可行性;流式细胞术和荧光显微镜分析显示,PTK7 Aptamer功能化微珠可以特异性捕获白血病细胞外泌体。通过优化捕获时间和HCR时间,确定了该方法的最佳实验条件。实验结果表明,我们的方法具有良好的信号放大效果,且外泌体浓度在100-4 000 pg/μL范围内具有良好的线性相关。同时,该方法成功地用于稀释血清样品中白血病细胞外泌体的检测,有望成为外泌体检测平台用于白血病的早期诊断。2.基于CD63 Aptamer功能化微珠富集和HCR信号放大的通用型肿瘤细胞外泌体检测平台针对单一外泌体检测繁琐耗时的问题,我们构建了一种以功能化微珠为捕获单元,肿瘤细胞的Aptamer为向导,HCR产物为信号单元的肿瘤外泌体的检测平台。首先,利用CD63 Aptamer功能化微珠富集肿瘤外泌体,考察了不同肿瘤细胞Aptamer对其外泌体的识别效果,并从中选出识别效果较好的Aptamer来做信号单元的头部来靶向目标外泌体。在这里,我们通过Aptamer-trigger诱导的HCR构建了一系列标记有不同荧光分子的信号单元,Aptamer带动信号单元去靶向目标肿瘤外泌体。此外,该方法可以通过调整Aptamer序列扩展成为一个通用的平台延伸到其它肿瘤外泌体的分析检测。本工作为同时检测多种肿瘤源性外泌体提供了一种新的方法。