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目的：腹泻是溃疡性结肠炎常见的临床症状,其产生主要与水盐(包括Cl-、 HCO3-和Na+)分泌和吸收不平衡相关。SLC26A3是位于肠上皮细胞顶端膜的离子转运蛋白,参与调控肠道Cl-、HCO3-和水的吸收与分泌。已有体外研究证实溶血磷脂酸(LPA)可提高SLC26A3的基因表达和离子转运功能,并可能成为治疗炎症性腹泻的候选药物,但是关于LPA在体内是否能提高SLC26A3表达并改善炎症性腹泻症状尚无研究报道,本课题首先对此进行观察。既往研究提示,LPA可以通过提高SLC26A3的启动子活性而上调SLC26A3的细胞膜表达和离子转运功能,但对LPA是否有助于提高SLC26A3细胞膜表达的稳定性和持续性却未见研究报道。鉴于SLC26A3的糖基化在肠道环境中对维持SLC26A3细胞膜表达的稳定性具有重要意义和PDZ结构蛋白NHERF4对SLC26A3黏膜表达持续性的影响,课题利用Caco2细胞观察LPA对SLC26A3糖基化水平的影响和NHERF4对LPA促SLC26A3蛋白细胞膜表达的影响,以期能进一步了解LPA调控SLC26A3细胞膜表达的相关机制。方法：利用4%葡聚糖硫酸钠(DSS)构建C57BL/6J小鼠急性结肠炎动物模型,设立正常对照组,观察小鼠的体质量、肠道出血情况、粪便含水量、结肠大体组织炎症损害和镜下病理组织学表现,参考Butzner JD标准进行结肠损伤组织学大体评分,参考Sutherland LR标准进行结肠炎疾病活动指数(DAI)评分,运用实时定量荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹实验分析炎症结肠的SLC26A3mRNA水平和蛋白表达,评估该动物模型应用于观察分析LPA对炎症性腹泻和离子转运体SLC26A3黏膜表达的影响的可行性。然后,对DSS诱导的急性结肠炎小鼠给予LPA灌肠治疗,设立正常小鼠组、模型组、磷酸盐缓冲溶液(PBS)灌肠处理组做为对照,观察LPA对结肠炎小鼠炎症性腹泻相关指标的影响,如体质量的下降、DAI评分、稀便的程度和黏膜炎症损伤程度,并观察分析LPA对中远段炎症结肠的SLC26A3mRNA水平和蛋白表达的影响,以评估LPA做为治疗炎症性腹泻候选药物的可能性。利用Caco2细胞,将LPA与Caco2细胞共孵育,以共孵育时间0小时、6小时、12小时、18小时为观察时间点,观察LPA对SLC26A3的基因表达、总蛋白表达、糖基化蛋白表达的影响。利用胰蛋白酶对SLC26A3蛋白的降解作用,设立LPA处理Caco2细胞组和LPA空白Caco2细胞组,以细胞和胰酶共孵育时间Omin、5min、10min、30min为观察时间点,观察分析LPA对SLC26A3细胞膜表面表达稳定性的影响。构建NHERF4质粒,转染Caco2细胞,设立转染NHERF4质粒的Caco2组(pIRES2-ZsGreenl-NHERF4-Caco2组,即NHERF4-Caco2组)、转染空质粒的Caco2组(pIRES2-ZsGreen1-NP-Caco2组,即NP-Caco2组)、LPA处理的转染NHERF4质粒的Caco2组(LPA+pIRES2-ZsGreenl-NHERF4-Caco2组,即LPA+NHERF4-Caco2组)、LPA处理的转染空质粒的Caco2组(LPA+pIRES2-ZsGreen1-NP-Caco2组,即LPA+NP-Caco2组)、LPA处理的Caco2组(即LPA+Caco2组)和LPA空白Caco2组(即Caco2组),以LPA与Caco2细胞共孵育12小时为观察时间点,分析Caco2细胞转染NHERF4质粒后,LPA对SLC26A3的细胞表达的影响是否发生改变,并观察分析LPA对NHERF4蛋白表达的影响,初步评价LPA、SLC26A3、NHERF4之间的相互作用关系。结果：1.在构建DSS诱导的C57BL/6J小鼠急性结肠炎动物模型实验中,模型组小鼠表现出粪便含水量增加、血便、炎症活动指数DAI值迅速上升、体质量明显下降。实验结束时,与对照组相比,模型组的结肠大体组织学炎症评分升高(p<0.05),结肠明显缩短(正常组vs.模型组：7.53±0.3cm vs.4.8±0.8cm,p<0.05),炎症结肠黏膜中SLC26A3mRNA表达明显下降(正常组vs.模型组：14.03±1.4vs.1.0,p=0.00),蛋白表达明显下降。2.在观察LPA对结肠炎小鼠炎症性腹泻和对炎症结肠段SLC26A3表达影响的实验中,所有饮用DSS的小鼠均表现出体质量下降,PBS处理组(实验前vs.实验后：17.02±0.19gvs.14.46±0.97g,p=0.001)和模型对照组(实验前vs.实验后：16.90±0.49g vs.13.5±0.90g,p=0.001)体质量明显下降,LPA处理组的体质量下降趋势明显减缓(实验前vs.实验后：17.36±0.67g vs.16.05±0.92g,p=0.06)。LPA处理组的粪便含水量上升幅度(18.89±8.67%)较PBS处理组(29.48±6.71%)和模型对照组(28.97±6.95%)明显减缓(p=0.049,p=0.041)。LPA处理组SLC26A3mRNA(2.27±0.4)较模型对照组(1.0)明显上升(p=0.03),模型对照组和PBS处理组(1.41±0.45)SLC26A3mRNA差异无显著性(p=0.09)。LPA处理组、模型对照组、PBS处理组的SLC26A3蛋白表达水平较正常对照组均降低,但LPA处理组SLC26A3蛋白表达较模型对照组和PBS处理组升高。3.在观察LPA对SLC26A3糖基化水平影响的实验中,LPA孵育12小时的Caco2细胞与LPA空白Caco2细胞相比,SLC26A3基因表达量增加1.67±0.03倍,蛋白表达量亦增加(相对β-actin的表达量,0.92±0.10vs.0.46±0.05,p<0.05),SLC26A3的细胞膜表达与细胞浆表达比增加(膜表达/浆表达：2.17±0.17vs.1.72±0.12,p=0.023),提示LPA在提高Caco2细胞SLC26A3总蛋白表达的同时,也有助于SLC26A3的细胞膜定位和表达。在观察LPA对SLC26A3蛋白抵抗胰酶降解的影响的实验中,LPA空白Caco2细胞的细胞膜SLC26A3蛋白在与胰酶共孵育10min后明显减少,而LPA孵育12小时的Caco2细胞的细胞膜SLC26A3蛋白在与胰酶共孵育后含量未出现明显减少,提示LPA可提高细胞膜SLC26A3蛋白抵抗胰酶降解的能力。4.在观察LPA与NHERF4在SLC26A3表达中的相互作用的实验中,与LPA+NP-Caco2组相比,LPA+NHERF4-Caco2组SLC26A3蛋白表达量明显减少(相对β-actin的表达量,0.27±0.042vs.0.56±0.022,p=0.003),提示NHERF4可弱化LPA的促SLC26A3蛋白表达作用。与NHERF4-Caco2组相比LPA+NHERF4-Caco2组NHERF4的蛋白表达量无明显改变,提示LPA对NHERF4的蛋白表达无明显影响。结论：LPA可提高炎症结肠黏膜的SLC26A3表达,并减轻DSS诱导的结肠炎性腹泻的严重程度,提示其可做为治疗结肠炎相关性腹泻的候选药物。LPA在Caco2细胞可提高SLC26A3的蛋白表达和糖基化水平并增强SLC26A3抗胰蛋白酶降解的能力。NHERF4可弱化LPA促进Caco2细胞SLC26A3蛋白表达的作用,但LPA对NHERF4的表达影响不显著。提示LPA可提高SLC26A3细胞膜表达的稳定性,但对SLC26A3细胞膜表达持续性的影响尚需进一步实验探讨。