在世界范围内，白内障已经成为一种眼科常见疾病，给患者的生活质量带来了严重的影响。白内障的致病因素和发生发展的机制随着研究的不断深入而逐渐清晰起来。如我们所知，紫外线和氧化应激会导致白内障的形成，很多相应的机制和有关学说因此被提出以解释晶状体混浊形成的原因。白内障患者可能存在针对紫外线和氧化应激防御的功能缺陷，使损伤因子更加容易地引发晶状体上皮细胞凋亡，这也许成为白内障形成的细胞学基础。通常情况下，紫外线暴露会导致晶状体内一系列复杂地急性或慢性反应，产生过剩的活性氧物质比如过氧化氢和过氧化物离子。活性氧除了会进一步引起晶状体蛋白质降解、交联和聚合，同时还会引起DNA损伤。接下来的过程中，DNA损伤也许会被修复，细胞继续存活；也许会导致程序化的细胞死亡或凋亡来清除出现问题的细胞个体，从而维持晶状体结构和功能的完整性。但是，如果大量细胞发生凋亡或者凋亡的细胞不能被增生所弥补，就会影响晶状体的生理功能，引起一系列病理改变。紫外线是人们日常生活中不可避免的环境因素，与一些皮肤肿瘤和眼科疾病的发生密切相关，因此对紫外线诱导晶状体细胞凋亡的研究很可能为揭示白内障的病因提供线索。　　 ELL相关因子2(ELL-associated factor2，Eaf2)是一种新发现的具有肿瘤抑制作用的蛋白质分子，人们对它的认识是从(11；19)(q23；p13.1)转位引起的急性白血病开始的。Eaf2具有增强ELL蛋白质转录延长活性的作用，从而加快RNA聚合酶Ⅱ催化的RNA合成反应。在一些研究中，人们利用紫外线照射细胞来诱导产生DNA损伤，结果显示原来弥漫分布在细胞核内的Eaf2重新定位到细胞核的核仁中，这种特殊的细胞内定位暗示了Eaf2很有可能参与DNA损伤的修复过程或者诱发细胞凋亡的发生。在一些激素起关键性作用的器官发生的肿瘤，比如前列腺癌，Eaf2显现出明显的抗肿瘤特性。如果将Eaf2转染到人类前列腺癌细胞中过表达，会引起宿主细胞发生caspase依赖的凋亡。Eaf2作为一种肿瘤抑制剂其肿瘤抑制作用很可能通过调节细胞凋亡和抑制细胞增殖的方式来实现的。而且根据Min Li等人的报道，在鼠的胚胎发育阶段就已经检测到Eaf2的表达，并推断Eaf2很可能在晶状体的发育、成熟过程中发挥重要作用。这暗示Eaf2很可能在胚胎发育阶段具有调控细胞凋亡的作用，并且Eaf2很可能在成熟晶状体中也存在一定水平的表达。　　 目前尚未有实验对成熟小鼠晶状体中Eaf2基因的表达情况进行描述，为此我们的实验发现正常小鼠晶状体中Eaf2基因在mRNA水平被转录，这意味着Eaf2蛋白很可能存在于晶状体细胞中并且发挥一定的生理作用。为了明确Eaf2蛋白质对紫外线诱导晶状体上皮细胞的凋亡作用，本课题将从以下几方面进行研究：(1)将构建的pEGFP-C1-Eaf2真核表达载体瞬时转染到商品化的alpha-TN4小鼠晶状体上皮细胞系，并表达EGFP-Eaf2融合蛋白，利用紫外线辐射诱导培养细胞发生凋亡，观察Eaf2是否对细胞凋亡具有调控作用。(2)利用Eaf2基因敲除小鼠模型进行TUNEL测试、caspase3蛋白质活性测定，研究Eaf2对紫外线诱导晶状体细胞凋亡的调节作用。(3)在Eaf2基因敲除小鼠模型中观察p53蛋白质是否会参与紫外线诱导的晶状体细胞凋亡过程，通过定量PCR技术研究Eaf2蛋白质是否会影响p53蛋白质的转录激活能力，以提高已知的一些下游促凋亡基因的表达。本研究将为揭示白内障的发病机制提供新的视角和途径。　　 材料与方法　　 一、实验材料　　 1、细胞株　　 alpha-TN4小鼠晶状体上皮细胞系为中国医科大学附属第四医院眼科晶状体实验室提供。　　 2、实验动物　　 实验用Eaf2基因敲除小鼠和正常对照小鼠由中国医科大学附属第四医院眼科晶状体实验室提供，并且基因敲除小鼠和正常对照小鼠均由Bm12小鼠构建。　　 二、主要研究方法　　 1、建立表达Eaf2蛋白质的细胞系　　 pEGFP-C1-Eaf2质粒和pEGFP-C1空载质粒的转化、扩增、提纯和酶切鉴定，以准备进行细胞转染。利用Liposuction2000转染alpha-TN4细胞株，通过倒置荧光显微镜观察目标蛋白的表达情况，明确Eaf2的细胞内定位，并通过流式细胞仪检测转染效率。　　 流式细胞仪检测紫外线诱导晶状体细胞凋亡的比率　　 紫外线辐射后，收集包括贴壁细胞和悬浮细胞在内的总细胞用于流式细胞仪进行分析。应用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测紫外线诱导的小鼠晶状体上皮细胞凋亡发生的情况。　　 2、紫外线(UV)辐射晶状体　　 小鼠一只眼暴露于紫外线灯照射下，另一只眼用铅片制作的眼罩遮挡。290nm-320nm的紫外线辐射总剂量为8kJ/m2，照射时间15分钟。　　 3、观察晶状体结构变化　　 紫外线辐射后24小时后。乙醚麻醉小鼠，断颈处死，摘取双眼(保留视神经长约2cm)。显微镜下取出部分小鼠眼球晶状体，称重。观察晶状体标本是否透明，是否出现空泡、水裂等混浊的征象。　　 4、TUNEL测定组织细胞凋亡　　 将整个眼球固定，60℃石蜡包埋，组织切片厚度为5μm。切片经二甲苯脱蜡，然后水化，过氧化氢封闭。利用TUNEL试剂盒标记组织切片内发生的细胞凋亡情况，然后显微镜下观察并拍照。　　 5、caspase3活性测定　　 casepase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定其吸光度来检测caspase3的活性。对小鼠晶状体蛋白质抽提后，进行caspase3活性测定，以便对凋亡发生情况进行量化体系的比较。　　 6、Western Blot检测p53蛋白的表达情况　　 p53蛋白质是一种参与细胞凋亡的重要物质，在凋亡内部通路中发挥作用。从小鼠晶状体中抽提总蛋白质后，利用SDS-PAGE电泳以及PVDF转印技术分离不同分子量的蛋白。封闭，p53一抗孵育过夜，相应二抗孵育，增强型化学发光，拍照，以β-actin为内参，条带进行灰度值分析。　　 7、RT-PCR和Real time RT-PCR测定mRNA的转录水平　　 使用Trizol吹打组织样本，氯仿分离总RNA，并使其沉淀。逆转录后进行琼脂糖凝胶电泳或实时荧光定量PCR，以研究Eaf2、p53、caspase3、Bid、Bax、Noxa、Puma、Apaf-1基因的转录水平。　　 8、统计学方法　　 应用SPSS12.0统计分析软件进行统计学分析，数据以均值士标准差(x±s)来表示。两样本间均数比较采用Independent t test。P<0.05视为有统计学意义。　　 实验结果　　 1、转染后目标蛋白质的表达情况　　 在转染后24小时，在荧光显微镜下观察到转染EGFP-C1-Eaf2质粒的细胞(Ⅰ组)和EGFP-C1质粒的细胞(Ⅱ组)呈现出绿色的荧光，无质粒转染的空白对照细胞未见绿色荧光。在Ⅰ组中，荧光聚集在细胞核中均匀分布；Ⅱ组中，绿色荧光分布在细胞质中。Ⅰ组的转染效率为47.7±1.8％，Ⅱ组转染效率为48.5±1.5%。　　 2、体外实验中Eaf2能够提高细胞凋亡率　　 转染EGFP-C1-Eaf2质粒的细胞(Ⅰ组)接受UV辐射后细胞凋亡率为26.41±1.95%，未接受UV辐射细胞凋亡率为16.23±0.82%；转染EGFP-C1质粒的细胞(Ⅱ组)接受UV辐射后细胞凋亡率为17.73±1.08%，未接受UV辐射细胞凋亡率为11.33±1.40%。Ⅰ组和Ⅱ组细胞在接受紫外线辐射后的细胞凋亡率均显著高于未接受紫外线辐射时的数值(P<0.05)；在相同的紫外线辐射条件下，表达EGFP-Eaf2融合蛋白的细胞的凋亡率要高于仅表达荧光蛋白EGFP的细胞的凋亡率(P<0.05)。　　 3、正常小鼠晶状体中Eaf2的表达情况　　 将总RNA提取物进行特异性RT-PCR并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示：Eaf2与对照基因β-actin的mRNA表达水平相似。　　 4、紫外线辐射不会影响Eaf2的表达　　 对正常小鼠接受紫外线辐射组和正常小鼠未接受紫外线辐射组的样本进行Real time RT-PCR测定，结果显示Eaf2基因的转录在两组之间并没有统计学差异(P>0.05)。　　 5、晶状体的宏观结构没有出现特异性改变　　 紫外辐射并没有引起正常小鼠组和Eaf2基因敲除小鼠组内各个样本出现晶状体混浊的现象，也没有出现水裂、空泡等特征性改变。　　 6、紫外线辐射诱导晶状体发生细胞凋亡　　 TUNEL测试显示大剂量紫外线辐射会引起晶状体上皮细胞发生明显的凋亡现象，同时在未接受紫外线辐射的样本中几乎没有发现凋亡细胞。在normal-UV组与Eaf2 K.0.-UV组之间，前者表现出更加显著的细胞凋亡水平。　　 7、Eaf2蛋白质会提高细胞内caspase3表达量和caspase3蛋白酶活性　　 通过Real time RT-PCR定量测定caspase3的mRNA表达情况以及样本的caspase3活性测定，结果显示：两种测试指标具有相同的结果，normal-UV组较normal-nonUV组显著提高(P<0.05)，Eaf2 K.0.-UV组较Eaf2 K.0.-nonUV组也显著提高(P<0.05)；并且normal-UV组较Eaf2 K.0.-UV组显著升高(P<0.05)。　　 8、p53在紫外线辐射诱导的凋亡细胞中表达增加　　 实验中p53基因的转录水平由定量RT-PCR测定，结果显示：normal-UV组较normal-nonUV组p53 mRNA表达量显著升高(P<0.05)；Eaf2 K.0.-UV组较Eaf2 K.0.-nonUV组p53mRNA表达水平同样显著提升(P<0.05)，并且各组样本进行p53蛋白质的Western Blot测定显示，接受紫外线照射的正常小鼠组的p53蛋白条带灰度值比未接受紫外线照射的正常小鼠组明显提高(P<0.05)；在接受紫外线辐射的基因敲小鼠组和未接受紫外线辐射的基因敲除组之间具有相似的蛋白质条带灰度值增高趋势(P<0.05)。　　 9、Eaf2蛋白质未对p53表达水平造成影响　　 在normal-UV组和Eaf2 K.0.-UV组的比较中，p53 mRNA的转录水平没有统计学差异(P>0.05)，同时在两组间进行的Western Blot测试也显示了相似的蛋白质条带灰度水平。也就是说，Eaf2并没有对p53的转录和表达造成影响。　　 10、紫外线诱导晶状体细胞凋亡过程中Bid基因、Bax基因和Apaf-1基因的表达情况　　 Real time RT-PCR技术测定了各组中Bid、Bax和Apaf-1基因的转录水平，normal-UV组较normal-nonUV组上述三种基因的转录副本含量显著提高(P<0.05)，同样Eaf2 K.0.-UV组较Eaf2 K.0.-nonUV组三种基因的转录水平显著升高(P<0.05)；但是在normal-UV组和Eaf2 K.0.-UV组之间没有统计学差异(P>0.05)。　　 11、紫外线诱导晶状体细胞凋亡过程中Noxa基因和Puma基因的表达水平比较　　 定量PCR技术检测了Noxa和Puma基因在各组的表达差异。normal-UV组与normal-nonUV组比较，Noxa和Puma基因的转录副本含量显著提高(P<0.05)；同样Eaf2 K.0.-UV组与Eaf2 K.0.-nonUV组比较，两种基因的转录水平显著升高(P<0.05)；而且，normal-UV组和Eaf2 K.0.-UV组比较，Noxa和Puma基因的mRNA表达水平升高并有统计学意义(P<0.05)。　　 结论　　 1、Eaf2蛋白质弥漫分布于小鼠晶状体上皮细胞alpha-TN4细胞核内，是一种核蛋白。　　 2、在体外实验中Eaf2蛋白质具有提高紫外线诱导晶状体上皮细胞凋亡水平的能力。　　 3、Eaf2基因在正常小鼠晶状体细胞中表达。　　 4、紫外线辐射本身不会导致Eaf2基因表达水平的改变。　　 5、Eaf2蛋白质具有促进紫外线诱导晶状体细胞凋亡的作用。　　 6、p53蛋白质参与紫外线诱导的晶状体细胞凋亡过程。　　 7、Eaf2通过上调Noxa和Puma促凋亡基因的表达来影响紫外线诱导晶状体细胞凋亡的水平。