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目的:探索青蒿琥酯（Artesunate,ARS）通过激活p62/Nrf2信号通路抑制活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,最终发挥抗类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）骨破坏作用。方法:体内实验:将雄性SD大鼠随机分为空白对照组（Control）、模型组（Model）、甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）组及 ARS 给药组（7.5、15、30mg·kg-1/d）,除空白组外,其他组建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）大鼠模型。首次免疫当天开始灌胃给药,每天1次,共给药30 d。同时观察并记录各组大鼠关节红肿畸形等症状、发病率、临床积分;HE染色和Masson三色染色观察关节滑膜组织、软骨表面、骨组织等的病理变化;TRAP染色观察膝关节破骨细胞生成情况;DHE-ROS荧光探针检测关节组织ROS的表达情况;生化检测试剂盒测定CIA大鼠血清中SOD和GSH的含量;RT-PCR和Western blot法检测关节组织中p62/Nrf2通路相关分子p62、Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1、NQO1以及溶骨相关因子CTSK、MMP-9、NFATc1 mRNA和蛋白表达水平;免疫组化检测关节组织中p62和Nrf2蛋白表达和分布情况。体外实验:建立小鼠原代骨髓巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）向破骨细胞分化模型,采用核因子-κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）诱导的同时给予不同剂量ARS干预,通过TRAP染色和肌动蛋白环染色以及骨片甲苯胺蓝染色观察破骨细胞的形成、活化和骨吸收能力;流式细胞术检测破骨细胞中ROS表达水平,同时免疫荧光检测不同分化阶段中ROS的变化情况;RT-PCR法检测破骨细胞相关因子TRAP,MMP-9,CTSK,NFATc1等和p62/Nrf2 信号通路关键分子 p62、Nrf2、HO-1、NQO1 的 mRNA 表达情况;Western blot法检测破骨细胞中p62、Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9,CTSK,NFATc1的蛋白表达水平;免疫荧光染色在位检测破骨细胞中Nrf2和NFATc1的表达和入核情况以及p62、MMP-9和CTSK的表达和分布情况。siRNA干扰降低p62的表达后,Western blot法测定破骨细胞中p62、Nrf2、HO-1、NQO1的表达水平,免疫荧光检测其中ROS的表达水平,并RT-PCR技术和免疫荧光染色检测破骨细胞中TRAP、MMP-9、CTSK和NFATc1的表达和分布情况。结果:1.青蒿琥酯改善CIA模型大鼠病情并抑制破骨细胞活化体内结果显示,CIA大鼠的肿胀度、临床积分、发病率及骨破坏程度随着病程的延长逐渐加重,而ARS给药组不仅能改善红肿症状、降低临床积分和抑制CIA大鼠关节腔中炎性细胞的浸润,滑膜组织的异常增生,而且能保护关节软骨和骨组织。此外,ARS还能明显抑制CIA模型大鼠关节组织中破骨细胞的活化以及溶骨相关因子CTSK、MMP-9和NFATc1的高表达。体外结果显示,RANKL组可见显著增多的TRAP阳性细胞、肌动蛋白环和紫蓝色的骨吸收陷窝,ARS给药组TRAP阳性细胞数目、肌动蛋白环形成以及骨吸收陷窝显著降低,且破骨细胞的关键标记性基因如NFATc1、MMP-9、CTSK、TRAP等的mRNA和蛋白表达水平明显被下调。2.青蒿琥酯抑制破骨细胞分化体系中ROS的产生与空白组相比,CIA模型大鼠关节原位ROS的产生明显增强,而ARS给药后显著抑制了原位ROS的产生。此外,与空白组相比,RANKL诱导组ROS表达显著增加,ARS给药后,对破骨细胞分化形成不同阶段产生的ROS均具有明显的清除作用。3.青蒿琥酯激活p62/Nrf2信号通路抑制ROS的产生与空白组相比,CIA大鼠关节组织中p62和Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1、NQO1 mRNA和蛋白表达降低,ARS给药后明显促进p62和Nrf2及HO-1和NQO1的表达。此外,ARS还能促进CIA大鼠血清中抗氧化酶SOD和GSH的表达。与空白组相比,RANKL诱导后破骨细胞中p62和Nrf2及HO-1和NQO1的表达降低,而ARS干预后p62和Nrf2及HO-1和NQO1 mRNA和蛋白表达升高的同时明显促进Nrf2向细胞核内转移。体外siRNA干扰降低p62的表达后,破骨细胞中ROS表达明显增多,同时ARS促进抗氧化酶表达和抑制ROS产生作用减弱,抑制破骨细胞分化形成作用随之降低。结论:●本研究明确了青蒿琥酯抑制破骨细胞形成、分化和骨吸收功能,延缓CIA大鼠骨破坏的同时,对体外破骨细胞分化体系中以及CIA大鼠关节组织中产生的ROS也具有明显的清除作用。●本研究证实青蒿琥酯能明显上调p62的表达,激活Nrf2的表达以及核转位,从而促进抗氧化酶HO-1和NQO1等的表达,最终抑制ROS的产生。反向验证也进一步明确了 ARS的抗RA骨破坏作用机制主要是通过靶向作用于p62,从而激活p62/Nrf2信号通路。