课题背景肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration, HLD)又名Wilson病(Wilson’s disease, WD),是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病,不同人群的发病率约为15～30/100万,其基因定位于13q14.3, cDNA编码由1465个氨基酸组成的分子量约165Kda的一种P型铜转运ATP酶(copper-transporting P-type ATPase, ATP7B)。WD患者由于ATP7B基因突变使位于肝细胞高尔基反面网状结构(trans-Golgi network, TGN)及胆管膜侧的ATP7B酶功能缺陷,引起铜离子跨膜转运障碍,导致铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP)合成障碍及胆汁中铜的排泄受限,过量的铜不能排泄出体外而在肝、脑、肾、角膜等部位沉积并引起相应的组织脏器损伤,患者可出现血清CP水平减低、肝硬化、神经/精神症状、角膜K-F环等临床表现。WD是少数可以治疗的神经遗传病之一,患者如果能在发病早期或症状前期被确诊并得到及时治疗,大多预后良好,反之病情逐渐加重甚至危及生命。但由于铜在不同脏器中沉积的速度和程度不同,许多患者早期症状复杂多样,极易被误诊为其他疾病,实验室铜代谢检查等又存在假阳性或假阴性结果,因此本病的早期诊断特别是症状前期和产前诊断较为困难。WD基因的克隆,使本病患者通过基因诊断技术进行症状前期及产前诊断成为可能。大量研究结果证实,WD基因存在高度的遗传异质性,各外显子的突变位点众多,目前已发现超过300种形式的基因突变,且多为复合杂合突变,常见突变形式少见,多为罕见突变,在不同人种的突变特征亦存在明显差异。这虽然解释了WD患者临床表现复杂多样的原因,但给基因诊断走向临床实用带来了困难。因此,明确不同地域、不同人群WD基因的突变热区和高频突变位点并采用PCR或多重PCR技术扩增相应人群的突变热区并进行序列比对分析,是检出WD患者的一种快速、高效的基因诊断策略。由于WD患者肝脏中铜的沉积通常经历肝铜蓄积期、肝铜饱和释放期等病理过程,大多在5～35岁之间起病。但近来的多个流行病学调查研究发现,40岁以上起病的晚发性WD患者并不少见。血清CP水平减低是WD的特征性生化改变,也是最主要的诊断依据,但约有5%左右的WD患者血清CP水平在正常范围。由于这两种特殊类型的WD患者在临床中极易被误诊误治,常给临床医生的WD诊疗工作带来困难,而基因诊断可为其提供最有力的诊断依据。血清CP由与铜离子结合的全CP(Holo-ceruloplasmin, Holo-CP)和未与铜离子结合的前CP(Apo-ceruloplasmin, Apo-CP)组成。研究发现,WD患者存在Apo-CP向Holo-CP转化障碍,血清中Holo-CP的表达水平较正常人明显减低。而血清CP水平正常的WD患者是否存在Apo-CP向Holo-CP的转化障碍,目前尚未见相关报道。本课题基于多年来WD基因诊断的研究进展及研究者所在单位数十年来在WD诊疗方面的工作基础,采用限制性酶谱分析及DNA测序等技术寻找中国人WD患者新的突变热区和高频突变位点,为建立可用于临床的快速、简便的基因诊断方法奠定基础；收集晚发性WD患者和血清CP水平正常的WD患者的临床资料和基因组DNA标本,分析其临床特征和突变规律,检测WD患者血清中Holo-CP的表达水平,尝试探讨WD患者可能的分子发病机制。实验目的1.寻找中国人WD患者新的基因突变热区和高频突变位点,为建立可用于临床的快速、简便的基因诊断方法奠定基础。2.研究中国人WD患者基因高频突变位点的基因型与临床表型的关系,探讨WD患者可能的分子发病机制。3.研究中国人晚发性WD患者和血清CP水平正常的WD患者的临床特征和基因突变规律,为这两类特殊类型的WD患者的基因诊断奠定基础,探讨其可能的分子发病机制。4.检测血清CP水平正常的WD患者血清Holo-CP的表达水平,结合其基因突变检测结果,探讨其可能的分子发病机制。实验方法本课题共包括四部分研究内容第一章：WD基因突变热区和高频突变位点的检测1.采用PCR-DNA测序技术检测来自华中和华东地区的139例非同源家系的WD患者ATP7B基因第13号外显子基因突变,以52名正常健康人为对照。2.采用限制性酶谱分析技术检测142例来自不同地区的非同源家系的WD患者ATP7B基因第8、12、13外显子,以52名正常健康人为对照。第二章：WD患者高频突变位点的基因型与临床表型关系的研究以限制性酶谱分析法检测的142例WD患者为研究对象,收集上述患者的临床资料、基因检测结果,以第8、13号外显子Arg778Leu和Pro992Leu突变作为基因型,将患者的性别、发病年龄、病程、临床分型、首发症状及CP和血清铜氧化酶(serum copper oxidase, Sco)活性等铜生化检测结果等临床表型作为比较的指标,探讨中国人WD患者高频基因突变位点的基因型与临床表型的关系,在此基础上探讨WD患者可能的分子发病机制。第三章：晚发性WD患和血清CP水平正常的WD患者的基因诊断及其临床特征分析收集13例晚发性WD患者和19例血清CP水平正常的WD患者的临床资料和基因组DNA标本,总结这两类特殊类型WD患者的临床特征,采用限制性酶谱分析技术结合全长外显子DNA测序技术分析其基因突变规律,探讨这两类特殊类型WD患者可能的分子发病机制。第四章：血清CP水平正常的WD患者血清Holo-CP表达水平的检测及其发病机制的探讨收集了19例血清CP水平正常的WD患者的血清标本,以30例正常健康人和30例血清CP水平明显减低的典型WD患者为对照,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel electrophoresis, native-PAGE)和Western blot技术检测WD患者和正常健康对照者血清Holo-CP(Holo-ceruloplasmin)的表达水平,结合其基因突变检测结果探讨可能的分子发病机制,尝试为本病患者提供一种较为敏感的蛋白标志物检测指标。实验结果第一章：WD基因突变热区和高频突变位点的检测1.PCR-DNA测序结果显示,52例正常对照者未发现突变,WD患者共检出Arg969Gln、Ser975Tyr、Thr977Met、Gly988Val、Pro992Leu和Ala1018Val等6种突变类型和1种2866-13C>G多态,其中Gly988Val杂合突变为新的发现(GENEBANK注册号为FJ705811), Arg969Gln在中国人WD患者中首次发现,Arg969Gln合并Gly988Val复合杂合突变对应较重的临床表型。WD患者组突变及多态总的检出率为29.49%(41/139),染色体突变频率为16.19%(45/278)。Pro992Leu纯合/杂合突变的检出率为23.02%(32/139),染色体突变频率为12.59%(35/278)。2.限制性酶谱分析结果显示,48.59%(69/142)的患者在第8外显子检出Arg778Leu突变,其中纯合突变13例,杂合突变56例；5.63%(8/142)的患者在第12外显子检出Thr935Met杂合突变；24.65%(35/142)的患者在第13外显子检出Pro992Leu突变,其中纯合突变3例,杂合突变32例。检出突变的患者中有12例为Arg778Leu/Pro992Leu复合杂合突变,1例Arg778Leu/Thr935Met复合杂合突变,1例Arg778Leu纯合突变合并Pro992Leu杂合突变,总检出率为69.01%(98/142)。以上结果均经DNA测序证实。第二章：WD患者高频突变位点的基因型与临床表型关系的研究1.142例WD患者中,Arg778Leu突变、Pro992Leu突变和Arg778Leu-Pro992Leu纯合/复合杂合突变与临床分型、首发症状、性别和病程等临床表型之间均无显著性差异(P>0.05)。2.142例WD患者中,Arg778Leu纯合突变、Pro992Leu纯合突变、Arg778Leu-Pro992Leu纯合突变患者的发病年龄分别小于Arg778Leu杂合突变和无Arg778Leu突变、Pro992Leu杂合突变和无Pro992Leu突变、单个杂合突变和无Arg778Leu、Pro992Leu突变的患者,但各组间无显著性差异(P值分别为0.556、0.784、0.465)。3.142例WD患者中,Arg778Leu纯合突变患者的血清Sco及CP水平低于Arg778Leu杂合突变和无Arg778Leu突变的患者,其中Sco水平无统计学意义(P值为0.058),CP水平有统计学意义(P值为0.038)。4.142例WD患者中,Pro992Leu纯合突变患者的血清Sco及CP水平低于Pro992Leu杂合突变和无Pro992Leu突变的患者,但各组间无显著性差异(P值分别为0.432、0.300)。5.142例WD患者中,Arg778Leu-Pro992Leu纯合突变、Arg778Leu-Pro992Leu复合杂合突变患者的血清Sco及CP水平显著低于单个杂合突变、无Arg778Leu突变和无Pro992Leu突变的患者(P值分别为0.033、0.011)。第三章：晚发性WD患和血清CP正常的WD患者的基因诊断及其临床特征分析1.13例晚发性WD患者中男性6例,女性7例；发病年龄40～60岁,平均(44.85±5.46)岁；病程0.3～8年,平均(2.61±2.21)年；肝型患者3例,脑型患者7例,脑-内脏型患者3例；以肝症状起病者6例,以锥体外系等神经系统症状起病者7例；有家族遗传病史者4例。血清铜、CP和Sco等铜生化检测结果均符合WD的改变,有5例以肝症状起病的患者入院时查肝功能结果异常；角膜K-F环阳性者12例,但有1例60岁发病者角膜K-F环为阴性；腹部超声检查结果显示患者均存在肝硬化改变,并伴有脾肿大、慢性胆囊炎等改变,脑型患者的头颅MRI等影像学检查示双侧基底节区异常信号。本组患者以神经系统症状起病者起病缓慢、肝损害症状较轻,驱铜治疗可获良好疗效；而以肝症状起病或伴发肝症状的患者出现明显的锥体外系症状和肝损害症状,病情相对较重,驱铜治疗后部分症状可获改善。2.13例晚发性患者的ATP7B基因各外显子及启动子区共发现Gln511Stop、Arg778Leu、Arg919Gly、Pro992Leu、Ala1018Val、Arg1041Trp等6种形式的突变和-75A>C、-129_-125del、Ser406Ala、Va1456Leu、Leu770Leu、2448-25G>A、Lys832Arg、Lys952Arg、Val1106Ile、Ala1140Val、3903+6T>C等11种形式的多态,11例患者的基因突变均在第8、12、13外显子,且均为杂合突变或复合杂合突变。在检出的突变类型中,第8外显子Arg778Leu和第13外显子Pro992Leu杂合突变在本组患者中的检出率分别为46.15%(6/13)和30.77%(4/13),未检出第12外显子Thr935Met突变,但在第12外显子检出2例Arg919Gly杂合突变。3.19例血清CP水平正常的WD患者中男性9例,女性10例；发病年龄4～31岁,平均(14.68±7.72)岁；病程0.1～15年,平均(3.89±4.09)年；肝型患者16例,脑型患者1例,脑-内脏型患者1例,症状前期的亚临床型患者1例；以肝症状起病者17例,以锥体外系等神经系统症状起病者1例,无症状者1例；有家族遗传病史者5例。血清铜、CP和Sco等铜生化检测结果正常或基本正常,有9例患者入院时查肝功能结果异常；角膜K-F环阳性者12例,角膜K-F环阴性者7例；腹部超声检查结果显示患者呈肝硬化或急性肝损伤的声像图改变；2例有神经系统症状的患者头颅影像学检查示双侧基底节区异常信号。有4例患者在外院行肝穿刺活检铜染色阳性,所有患者均行青霉胺负荷试验(penicillamine challenge test, PCT)确诊。4.19例血清CP水平正常的WD患者ATP7B基因启动子及各外显子共发现11种形式的突变和14种形式的多态。其中,1870-65G>A、Met645Leu、2575+81A>G和Ala874Pro等4种突变为未曾报道的新的突变类型。本组19例患者中有16例患者检出突变,有3例患者未检出任何致病突变,其突变检出率为84.21%(16/19)。在检出突变的患者中,有3例患者为纯合突变,有2例患者每人存在2种杂合突变即复合杂合突变,其余检出突变的患者每人只存在1种杂合突变类型,突变形式以错义突变为主,但有3种剪接点突变。本组患者Arg778Leu的检出率为15.79%(3/19),未检出Thr935Met和Pro992Leu突变。第四章：血清CP水平正常的WD患者血清Holo-CP表达水平的检测及其发病机制的探讨1.正常健康人组和血清CP水平正常的WD患者组可见比较靠近的Apo-CP和Holo-CP 2条条带,血清CP水平明显减低的典型WD患者Apo-CP条带较为明显,Holo-CP条带较暗或缺失。2.血清CP减低的WD患者组和CP正常的WD患者组Holo-CP的表达水平均低于正常健康人组,三组间有极显著性差异(F=207.544,P=0.000)。结论1.139例华中和华东地区WD患者ATP7B基因第13号外显子发现6种形式的突变和1种多态。2.139例华中和华东地区WD患者ATP7B基因第13号外显子发现一种未曾报道的Gly988Val突变,并在中国人WD患者中首次发现Arg969Gln突变。Arg969Gln合并Gly988Val复合杂合突变对应较重的临床表型。3.第13号外显子是中国人WD患者ATP7B基因的一个突变热区。4.限制性酶谱分析技术检测WD基因第8、12、13号外显子能明显提高中国人WD患者基因突变的检出率,可用于临床对WD疑诊患者的快速筛选。5.Pro992Leu突变是中国人WD患者的一个高频突变位点。6.142例中国人WD患者Arg778Leu突变、Pro992Leu突变和Arg778Leu-Pro992Leu复合杂合突变与临床分型、首发症状、性别、病程和发病年龄等临床表型之间无相关性。7.142例中国人WD患者Arg778Leu纯合突变、Pro992Leu纯合突变和Arg778Leu-Pro992Leu复合杂合突变的血清Sco及CP水平低于单个杂合突变和未检出Arg778Leu突变和Pro992Leu突变的患者。8.Arg778Leu纯合突变和Pro992Leu纯合突变是对WD蛋白功能影响较大的致病性突变。9.13例晚发性WD患者中以神经系统症状起病者主要表现锥体外系症状,肝损害症状较轻,驱铜治疗可获良好疗效。10.13例晚发性WD患者中以肝症状起病者病情相对较重,并可伴有锥体外系症状,驱铜治疗后部分症状可获改善。11.13例晚发性WD患者共发现6种突变类型和11种多态类型。12.13例晚发性WD患者均为杂合突变或复合杂合突变,Arg778Leu杂合突变和Pro992Leu杂合突变检出率分别为46.15%和30.77%。13.19例血清CP水平正常的WD患者以肝损伤症状为主要临床表现,但也有以脑症状起病或亚临床型的无症状患者。14.19例血清CP水平正常的WD患者共发现11种形式的突变和14种形式的多态。15.19例血清CP水平正常的WD患者Arg778Leu突变的检出率为15.79%,未检出Thr935Met和Pro992Leu突变。16.19例血清CP水平正常的WD患者发现4种未曾报道的新突变类型。17.采用native-PAGE和Western blot检测结果显示,血清CP减低的典型WD患者血清Holo-CP的表达水平明显减低,存在Apo-CP向Holo-CP的转化障碍。18.采用native-PAGE和Western blot检测结果显示,血清CP水平正常的WD患者血清Holo-CP的表达水平显著低于健康对照者(P=0.013),Apo-CP向Holo-CP的转化障碍也是其重要发病原因。对于临床难以诊断的WD疑诊患者,采用native-PAGE和Western blot检测Holo-CP的表达水平是一种较为敏感的诊断指标。本课题的主要创新点1.139例华中和华东地区WD患者ATP7B基因第13号外显子发现一种未曾报道的Gly988Val突变,并在中国人WD患者中首次发现Arg969Gln突变。2.第13号外显子是中国人WD患者ATP7B基因的一个突变热区。3.Pro992Leu突变是中国人WD患者的一个高频突变位点。4.142例中国人WD患者Arg778Leu纯合突变、Pro992Leu纯合突变和Arg778Leu-Pro992Leu复合杂合突变的血清Sco及CP水平低于单个杂合突变和未检出Arg778Leu突变和Pro992Leu突变的患者,Arg778Leu纯合突变和Pro992Leu纯合突变是对WD蛋白功能影响较大的致病性突变。5.13例晚发性WD患者共发现6种突变类型和11种多态类型,均为杂合突变或复合杂合突变,Arg778Leu杂合突变和Pro992Leu杂合突变检出率分别为46.15%和30.77%。6.19例血清CP水平正常的WD患者以肝损伤症状为主要临床表现,但也有以脑症状起病或亚临床型的无症状患者。7.19例血清CP水平正常的WD患者共发现11种形式的突变和14种形式的多态,并发现4种未曾报道的新突变类型。8.采用native-PAGE和Western blot检测结果显示,血清CP水平正常的WD患者血清Holo-CP的表达水平低于正常对照者,也存在Apo-CP向Holo-CP的转化障碍,对于临床难以诊断的WD疑诊患者,采用native-PAGE和Westernblot检测Holo-CP的表达水平是一种较为敏感的诊断指标。