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在世界能源需求日益增长,环境污染问题日趋严重的背景下,可再生能源、材料以及化学品的生产受到了愈来愈多的关注。丙酮酸是一些高值化学品如丙氨酸、苯丙氨酸衍生物、异丁醇和类胡萝卜素等的直接或间接前体,其本身可广泛应用于药物、农药及食品等方面。在生物细胞内,丙酮酸不仅是连接EMP途径及TCA循环的代谢关键点,同时也是糖类和脂类等化合物代谢的中间产物,以及几种生物大分子的合成前体,在细胞代谢过程中发挥关键作用。多种微生物如大肠杆菌(Escherichia coli),光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata),谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum),酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等已被利用以葡萄糖为底物生产丙酮酸,且丙酮酸为主要发酵产物。产酸克雷伯氏菌是一种工业上广泛应用的宿主细菌,可以用来生产2,3-丁二醇、1,3-丙二醇、乙醇及乳酸等多种生物基化学品。本文尝试以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)为宿主细菌生产丙酮酸。在本文中,首先研究了实验室前期构建的几株产酸克雷伯氏菌突变菌株中乳酸脱氢酶ldh基因对丙酮酸产生的影响。实验室以获得的产酸克雷伯氏菌PDL-0经过敲除2,3-丁二醇、乙醇、乙酸和琥珀酸等产物的合成途径后,获得产酸克雷伯氏菌PDL-5、PDL-6与PDL-7,由于3株改造菌株是利用甘油生成乳酸菌株,所以乳酸脱氢酶的活性普遍较高,这对产酸克雷伯氏菌生产丙酮酸不利,通过敲除乳酸脱氢酶基因将有利于丙酮酸的积累;同时丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因的敲除可以降低乙酸的产生,增加丙酮酸的积累,因而后续通过代谢途径重构,敲除了菌株PDL-7中的乳酸脱氢酶ldh基因和丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因,得到菌株PDL-7 ΔpflBΔldh。考虑到副产物合成途径的敲除会造成NADH的积累与胞内氧化还原状态的失衡,不利于细菌生长及丙酮酸的积累,尝试在PDL-7ΔpflBΔldh中导入外源NADH氧化酶基因nox,其在胞内的表达可以氧化NADH生成NAD+,实现胞内NAD+的再生,从而推动细菌生长及丙酮酸的积累。通过上述代谢工程手段,得到菌株PDL-7 ΔpflBΔlD::nox,实现代谢途径重构和还原力的平衡,丙酮酸产量达到54.99 g/L,丙酮酸/葡萄糖的得率为0.859 g/g。为了进一步降低丙酮酸的生产成本,提高丙酮酸产量,对产酸克雷伯氏菌PDL-7 ΔpflBΔlhD::nox的发酵条件进行了优化。具体流程为:首先对文献报道的8种产酸克雷伯氏菌培养基配方进行优化,然后对发酵过程中的溶氧条件包括转速、通气量等进行优化,最后对发酵过程使用的中和剂进行优化。确定优化后的发酵条件为:2号培养基(无酵母粉培养基),转速600 rpm,通气量1.6 vvm,利用中和剂KOH调节pH～6.8,菌株产酸克雷伯氏菌PDL-7 ΔpflBΔlhD::nox在54 h内消耗121 g/L葡萄糖生成61.57 g/L丙酮酸,丙酮酸/葡萄糖的得率为0.509 g/g。尝试利用混合糖(主要是葡萄糖和半乳糖)发酵生产丙酮酸,进一步降低丙酮酸的生产成本。甲基乙二醛是多种糖代谢的抑制剂,文献报道敲除甲基乙二醛合酶基因mgsA可以提高混合糖的利用效率。为提高产酸克雷伯氏菌对混合糖的利用效率,构建了产酸克雷伯氏菌突变株PDL-7 ΔpflBΔldh::noxΔmgs,为进一步促进半乳糖的转运,将来源于大肠杆菌的半乳糖透性酶基因(galP)导入到突变株中,获得菌株PDL-7ΔpflBΔldhD::noxΔmgs pDK7-galP,该菌株可在20 h内消耗葡萄糖17.3 g/L,伴随5.32 g/L的半乳糖消耗,表明半乳糖透性酶galP基因表达的能够促进葡萄糖及半乳糖的共利用。