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手足口病是由多种微小RNA肠道病毒引起的急性传染病,多发生于三岁以下儿童,其表现主要是轻度流感样症状和手、足、口腔等部位的皮疹和疱疹,通常具有自限性,但传染性极强,常常在幼儿园和托儿所流行。一般预后良好,但是个别重症患者可出现严重的神经系统并发症,甚至死亡。引起手足口病的病原体属于微小RNA病毒科肠道病毒属,主要包括:柯萨奇病毒A组4、5、7、9、10、16型;柯萨奇病毒B组2、5型;埃可病毒以及肠道病毒71(EV71)型,其中CA16和EV71为主要病原体。自1969年首次从美国一名患有脑膜炎的手足口病患儿中分离出EV71型病毒以来,手足口病在世界各国出现多次爆发和流行,尤其是亚太地区,中国大陆2008年到2012年报道有7,200,092例手足口病患者,死亡2457例。2008年台湾报道387例由EV71导致的重症病例,其中14例死亡。目前肠道病毒感染除了脊髓灰质炎病毒有疫苗外,其余肠道病毒感染包括EV71病毒感染并没有特殊的治疗药物,其中一个很重要的原因就是缺少稳定的动物模型来有效地评估疫苗。目前最常用的模型有猿猴模型和乳鼠模型,猿猴模型虽然早期被认为是较好的动物模型,但是由于价格昂贵,并且缺乏心力衰竭和肺水肿的表现,而这些表现常常是人类手足口病重要的死亡原因,所以限制了其应用。乳鼠模型由于价格低廉,制备简单,神经系统感染表现与人类疾病相似,因此适用于了解EV71致病机制、评价疫苗效价。现阶段,我国手足口病爆发流行的病毒株亚型主要是C4亚型,而在以往的研究中,大多数动物模型对C4亚型的EV71病毒株不敏感,导致感染后不能出现典型的手足口病的症状,尤其是神经系统感染症状。本研究对来自江苏省疾病预防控制中心4株EV71临床分离株进行了小鼠攻毒实验,筛选出1株能引起小鼠后肢瘫痪的临床毒株。对该株进行了细胞培养、传代、克隆,建立了稳定的G03 EV71病毒株,并对该毒株进行了全基因序列的测定和分析,结果表明该病毒株为C4亚型的EV71病毒株。用分离的G03 EV71病毒株通过颅内途径感染1日龄ICR小鼠制备动物模型,每天观察动物的临床表现,了解EV71感染的规律和致病特点,同时定期处死动物,采集各器官组织进行动物体内病毒半定量分析、病理形态学观察、免疫组织化学分析及利用Western blot鉴定病毒蛋白的表达等。病理学观察发现,在感染G03后小鼠的心肌、肺组织、骨骼肌、小肠、脑组织等器官出现特定的病理变化,比如出血、炎症细胞浸润等。免疫组化显示感染后所取小鼠的上述五种组织都有EV71病毒特异性分布。Western blot分析发现EV71 VP1蛋白在小鼠五种组织都有表达,以上结果都显示成功建立了EV71感染小鼠模型,为下一步体内干预实验研究奠定了良好的基础。综上所述,本研究通过筛选EV71临床敏感株实验,筛选出合适的临床毒株,并对其进行了培养,同时利用此毒株建立了一日龄乳鼠模型,也建立了相应的检测方法,为EV71发病机制、病毒疫苗的研制等研究提供了实验工具。