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工作目的 癌性疼痛作为晚期癌症患者最常见的临床症状之一,严重影响了患者的生活质量。由于目前广泛用于治疗癌痛的阿片类药物存在中枢神经系统毒副反应、药物耐受等问题,许多癌痛患者的症状尚未得到理想控制。血脑屏障/血脊髓屏障是外周血液循环与中枢神经系统之间的动态屏障,是外周与中枢间选择性物质交流的“桥梁”。血脑屏障/血脊髓屏障的损害可导致中枢神经系统一系列病变,许多病理状态与其通透性的升高相关。新近研究发现,某些病理性疼痛如炎性痛、神经病理性疼痛出现血脑屏障/血脊髓屏障通透性改变,但具体发生机制目前尚不明确,因此也缺乏靶向血脑屏障/血脊髓屏障镇痛措施的研究。此外,目前关于血脑屏障/血脊髓屏障与骨癌痛之间的研究几乎为零。本研究拟在骨癌痛模型小鼠的基础上,首次探讨血脊髓屏障渗透性改变在骨癌痛形成中的作用及其相关机制,并进一步针对血脊髓屏障进行干预,为临床防治骨癌痛提供新思路和理论依据。研究方法 1.本研究采用雄性C3H/HeN小鼠骨癌痛模型,通过测定自发抬足次数和机械缩足阈值来评估痛行为学、股骨切片HE染色观测肿瘤生长,以此判断骨癌痛模型是否成功建立。血脑屏障/血脊髓屏障渗透性分析采用伊文氏蓝染液定量测定。Western blotting和免疫荧光测定小鼠脊髓水平紧密连接蛋白的表达;2.ELISA或Western blotting和/或免疫荧光测定小鼠外周/脊髓水平促炎因子TNF-α 和 IL-1β、MMP-9 和 VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR-2 的表达;3.外周/鞘内给予VEGFR-1和VEGFR-2非选择性抑制剂Axitinib和VEGFR-2选择性抑制剂Ki8751,机械缩足阈值评估其镇痛效果,伊文氏蓝染液测定对血脊髓屏障的作用,Western blotting测定脊髓水平VEGFR-1、VEGFR-2和紧密连接蛋白的表达,免疫荧光检测股骨骨髓腔内VEGFR-1、VEGFR-2和IL-1β的表达,以及脊髓水平星形胶质细胞和小胶质细胞的活化状态,RT-PCR测定Shh通路相关分子转录水平的变化。结果 1.痛行为学及HE染色结果显示小鼠在模型建立后第14天开始出现稳定的自发抬足次数上升和机械缩足阈值下降,患侧骨髓腔内出现大量肿瘤细胞浸润和骨质破坏,伴随血脊髓屏障渗透性明显上升,紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5表达明显下调,并持续至造模后第28天;2.ELISA结果显示骨癌痛小鼠外周促炎因子、MMP-9和VEGF-A水平无明显变化,Western blotting和免疫荧光结果显示骨癌痛小鼠在造模后第4天出现VEGFR-1表达上升,第14天脊髓水平出现VEGFR-2表达显著上升,并且主要表达于血管内皮细胞;3.造模后第14天单次腹腔和鞘内给予Axitinib及Ki8751,发现高剂量组(Axitinib腹腔注射40 mg/kg,鞘内注射3 nmol/只;Ki8751腹腔注射30 mg/kg,鞘内注射3 nmol/只)在给药后2小时可以有效缓解骨癌痛小鼠的机械痛敏,下调血脊髓屏障渗透性,上调紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的表达,并减少小胶质细胞的激活,减少肿瘤侧骨髓腔内IL-1β的表达,这种镇痛作用通过腹腔注射最多持续24小时,鞘内注射最多可以维持至72小时,并在给药后期抑制脊髓水平星形胶质细胞的激活和Shh信号通路。结论 骨癌痛小鼠在疼痛形成的过程中出现了血脊髓屏障渗透性的增加,脊髓水平VEGFA-VEGFRs通路的激活可能参与血脊髓屏障的完整性破坏的过程。通过抑制外周骨髓腔内肿瘤细胞和/或单独抑制血脊髓屏障血管内皮细胞表达的VEGFR-1和/或VEGFR-2可以有效保护血脊髓屏障的完整性,从而改善骨癌痛。